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摘要：文章为考察种子培养过程中葡萄糖流加对多黏菌素E生物合成代谢的影响，对发酵过程中的DO、CER、OUR、RQ和活菌细胞量等重要生理参数实施了在线检测，并对黏菌素效价E2和E1进行了分析。研究显示，种子发酵过程中流加葡萄糖过多，与CER和E2/E1均呈正相关，碳阻遏效应显著；通过流加液体葡萄糖，可使糖点在0.03~0.06 g/100 mL，CER为44.1 mmol/（L·h）；当菌体处于最佳产素期，且RQ在1.0~1.2时，移种进入发酵培养，效价涨幅较高，发酵培养黏菌素效价可提高到75万U/mL，提升7.14%。
关键词：多黏菌素E；发酵；呼吸商；代谢特性；组分
多黏菌素E作为一种碱性多肽类抗生素，具有消化道不易吸收、排泄迅速、毒性小、无副作用、不易产生耐药菌株[1]等优点，是市场需求量较大的兽用抗生素之一。
多黏菌素E由多黏类芽孢杆菌通过非核糖体多肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase，NRPS）合成[2]。其机制是通过改变细菌细胞的渗透性来发挥杀菌功效。多黏菌素E由环状7肽、线性3肽、疏水酰基尾3部分组成，当疏水酰基尾中-R2为-CH3时，构成甲基辛酸，为多黏菌素E1组分；当疏水酰基尾中-R2为-H时，构成异辛酸，为多黏菌素E2组分[3]。
多黏菌素E的发酵过程控制对于发酵效价和组分比例有着至关重要的影响。本文通过对工业规模13 m3反应器中多黏菌素E种子培养过程中的耗氧速率（OUR）、二氧化碳释放率（CER）、呼吸商（RQ）、溶氧（DO）和活菌细胞量等重要生理参数实施在线监测，利用多尺度研究方法[4-5]对多黏菌素E种子培养过程中不同流加葡萄糖速率展开代谢特征和组分研究，确定了最佳的种子罐流加葡萄糖工艺，提高了多黏菌素E的发酵水平。
1材料与方法
1.1实验材料
菌种：多黏类芽孢杆菌，由河北圣雪大成唐山制药有限责任公司提供。
种子培养基（g/L）：淀粉30，脱脂豆粕21.7，硫酸铵11.7，磷酸二氢钾2.1，淀粉酶0.03，聚醚消沫剂5.1。将pH调至7.4。
仪器设备：13 m3生物反应器，两层搅拌叶；岛津色谱仪；Magellan Tandem pro gas analyser，Biomass Monitor 220。
1.2实验方法
（1）在线参数分析
将发酵过程中排出的O2和CO2利用质谱仪测定后，通过“发酵之星”软件进行处理，以在线计算各参数，包括OUR、CER、RQ和DO等。
（2）在线活细胞量分析
利用活细胞传感仪检测发酵过程中的活菌细胞量，在线采集电容值和电导率[6]。
（3）多黏菌素E测定采用HPLC进行测定。
2结果与分析
2.1多黏菌素E种子发酵过程关键参数变化特征（pH/OUR/CER/RQ/DO/电容值）
多黏菌素E种子发酵过程曲线如图1所示。
数据显示，种子培养过程中DO最低在60%左右；CER、OUR和电容值在种子培养过程中2次达到峰值后下降；RQ与CER的变化趋势相同，在黏菌素合成速率较高时期，RQ维持在1~1.2。
在种子培养过程中，已开始合成黏菌素E，移种时效价21.6 U/mL。黏菌素主要有E1、E2两种结构。种子培养时，30 h前E2/E1呈上升趋势；30 h后E2/E1呈下降趋势，移种时E2/E1为1.5。
2.2流加葡萄糖对黏菌素种子活力和组分的影响
为避免淀粉水解速率限制菌体耗糖，从而影响菌体活力，分别在种子培养过程中开展2种不同流加葡萄糖速率实验，以观察其对种子活力的影响。将不流加葡萄糖的工艺作为对照组CK，在流加葡萄糖的实验A种子培养过程中，18 h糖点最高达0.33 g/100 mL；26~38 h糖点维持在0.1 g/100 mL左右。在流加葡萄糖的实验B种子培养过程中，糖点始终在0.02~0.06间波动。具体如图2所示。
研究发现，葡萄糖流加量对菌体的CER、RQ和电容值具有显著影响。实验A种子培养过程中碳源充足，CER在18~29 h的增长速度低于前一阶段和后一阶段培养时间，且与糖点呈现明显的对应关系，表明糖点高于0.12 g/100 mL会影响菌体生长代谢，黏菌素发酵过程中存在明显的葡萄糖阻遏效应[7]；CER与活细胞量同步增长，种子液移种时，CER显著高于对照组CK。实验B由于流加葡萄糖量较少，培养过程糖点较低，CER在22 h后出现了先下降再回升的情况，与对照组CK趋势一致，但下降幅度较小；28 h后的CER增长速率小于实验A，高于对照组CK。
种子培养过程中的RQ[8]同样会受到流加葡萄糖的影响，如图2所示。由于实验A和实验B都流加葡萄糖，可得出种子液移种时RQ均高于对照组CK。在菌体分泌黏菌素的过程中，菌体RQ显著受到碳源质量浓度的影响[9]，且与黏菌素的产素效率呈现出相关性，可用于表征菌体的产素活力。
由图3可分析流加葡萄糖对种子罐效价和E2/E1的影响，以及进入发酵培养的菌体活力。由于实验A提供了充足的碳源，种子培养过程中效价涨幅较高，进入发酵培养22 h后效价略高于对照组CK，但发酵培养22~30 h后的涨幅明显低于对照组CK，且发酵84 h后效价也低于对照组CK。实验B种子液移种时，效价涨幅低于实验A，但进入发酵罐后，效价涨幅最高，放罐效价为75万U/mL，比对照组CK黏菌素效价高出7.14%。可见，通过种子罐少量流加葡萄糖，可使种子液移种时菌体处于最佳产素期，且进入发酵罐培养黏菌素效价涨幅较好。
种子液的黏菌素E2/E1与流加葡萄糖存在密切联系。种子液E2/E1高，则对应发酵培养的E2/E1高。实验A发酵培养过程中效价的E2/E1呈下降趋势，且降幅高于实验B，表明发酵过程中E2涨幅衰退高于E1涨幅衰退，而E2含量占比较大，使得发酵中后期黏菌素效价涨幅低，发酵84 h时效价低于对照组CK；实验B中E2/E1呈先上升后下降状态，虽峰值比实验A低，但中后期E2/E1降幅低于实验A，表明E2涨幅衰退较E1少。可见，中后期效价涨幅较为理想，放罐效价最高。具体如图3所示。
3结论
在黏菌素二级发酵过程中，种子的活力至关重要。因此，不仅要保证移种时具有足够的菌量，还需保证在种子处于最佳产素期时进行移种。同时，适宜的E2/E1也会使黏菌素的其他组分比例保持正常。
若种子流加葡萄糖过多，种子移种时CER就会偏高，进而出现明显的碳阻遏现象。这与孙仲奇在《代谢调控对多黏菌素E合成的影响》中提出的结论一致[10]，黏菌素E2/E1较高，E2虽增长速率较高，但RQ为1.4，不是最佳产素数值，菌体代谢方向发生偏移，代谢流更多地流向初级代谢，菌量较大。进入发酵培养时，前期效价过高，后期涨幅较差，最终发酵培养时黏菌素效价较低；种子液碳源明显不足时，CER偏低，菌量少，黏菌素E2/E1略低，E2增长速率偏低，RQ为0.63，菌体未达到最佳产素期，在此条件下发酵培养时，前期生长偏慢；在种子液培养过程中流加适当的葡萄糖，菌体处于最佳产素期时，移种进入发酵培养，效价涨幅较高，发酵培养的黏菌素效价提高到75万U/mL，提升了7.14%。
参考文献
［1］沈绍清,任浩洋,蔡芸.多黏菌素联合用药研究进展［J］.中国抗生素杂志,2016,41(3):166-172.
［2］AZZOPARDI EA,FERGUSON EL,THOMAS DW,et al.Colistin past and future:A bibliographic analysis［J］.Journal of Critical Care,2013,28(2):13-19.
［3］YU Z L,QIN W R,LIN J X,et al.Antibacterial mechanisms of polymyxin and bacterial resistance［J］.BioMed Research International,2015:679109.
［4］王萍,王泽建,张嗣良.生理代谢参数RQ在指导发酵过程优化中的应用［J］.中国生物工程杂志,2013,33(2):88-95.
［5］张嗣良,储炬.多尺度微生物过程优化［M］.北京:化学工业出版社,2003.
［6］王泽建,王萍,张琴,等.微生物发酵过程生理参数检测传感器技术与过程优化［J］.生物产业技术,2018(1):19-32.
［7］LIU MZ.Global transcriptional programs reveal a carbon source foraging strategy by Escherichia coli［J］.The Journal of Biological Chemistry,2005,280(16):15921-15927.
［8］张嗣良.工业生物过程优化与放大研究中的科学问题—生物过程环境组学与多尺度方法原理研究［J］.中国基础科学,2009,11(5):27-31,13.
［9］高圣君,杭海峰,陈中兵,等.流加葡萄糖策略对盐霉素生物合成调控影响［J］.中国抗生素杂志,2013,38(8):579-583.
［10］孙仲奇.代谢调控对多黏菌素E合成的影响［D］.杭州:浙江工业大学,2016.后台-系统设置-扩展变量-手机广告位-内容正文底部 -
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葡萄糖流加对多黏菌素E生物合成代谢的影响论文
人参与 2025-04-25 10:21:02 分类 : 理学 点这评论 作者：团论文网 来源：https://www.tuanlunwen.com/
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