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摘要：从变性PAGE中获得高纯度、高回收率的ssDNA，是功能核酸研究及适配体筛选的关键环节之一。文章采用直取法、改良煮沸法、试剂盒回收和正丁醇回收4种方法，在尿素变性PAGE中对ssDNA进行了提取回收研究，并发现改良煮沸法的ssDNA回收效率显著优于其他3种回收方法。对实验条件作进一步优化，使ssDNA回收效率达到了70.33±0.35%，并获得了较高的回收纯度（A260/A280=1.85）。可见，该种方法操作简便、回收速度快，且不易受有机试剂的干扰，同时成本低廉，单次回收成本不足1元，在功能核酸的筛选及回收利用方面具有良好的实际应用前景。
关键词：尿素变性PAGE；ssDNA回收；改良煮沸法
尿素变性PAGE主要用于分离、鉴定和纯化单链DNA（ssDNA）片段。该技术操作简单，能有效分离密度梯度离心等其他方法难以实现满意分离的ssDNA片段。在适配体等功能核酸筛选过程中，可以通过PAGE电泳来观察、纯化和回收ssDNA片段。例如，PU等[1]在适配体筛选中，从琼脂糖凝胶中提取ssDNA，并利用磁分离回收ssDNA，回收率达到63.88%。相较而言，利用试剂盒回收ssDNA，回收率较低，仅为0.38%~46.64%。刘晓敏、李同心[2]在PAGE中利用煮沸法回收得到的ssDNA提取率为59.09%，回收效果不佳且回收纯度不高。因此，在尿素变性PAGE中，探索提高ssDNA回收效率的方法具有重要的现实意义。
文献调研发现，ssDNA回收技术经历了从传统的苯酚-氯仿提取法[3]到现代的柱净化法、磁珠法、试剂盒回收法等多种回收方案[4-5]。这些技术分别适用于不同的实验需求和样本类型。例如，柱层析法因操作简便、回收率高而被广泛应用[6]，但存在成本较高、不适合大规模样本处理等局限；磁珠法虽然回收效率高[7]，但不适用于凝胶回收；试剂盒回收虽然操作简便[8]，但需要使用较多的有机试剂，且回收后得到的提取物中含有各种有机试剂，回收效率偏低，影响了ssDNA适配体筛选的后续应用。因此，不断探索和优化ssDNA回收方法，开发出一种高效、经济、环保的ssDNA回收法，仍是目前研究的热点。
本文从尿素变性PAGE中开展了ssDNA的提取回收，并对直取法、改良煮沸法、试剂盒回收和正丁醇回收4种ssDNA回收方法的回收率及DNA纯度进行了比对分析。针对获得较高回收率及纯度的改良煮沸法，从煮沸时间、尿素变性PAGE上样量与加水量的比值、离心时间，以及上样ssDNA浓度4个要素着手，开展了下一步实验条件优化，致力获得较高的ssDNA回收率和ssDNA纯度。结果表明，该方法易于操作、简便快速，且无须用到特殊的贵重仪器，可为后续功能核酸的筛选及功能研究提供关键的技术支撑。
1材料与方法
1.1试剂和材料
ssDNA核酸序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成：AGCAGCACAGAGGTCAGATGACAGA ACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCCCTATG CGTGCTACCGTGAA（74 nt-ssDNA）。
试剂：EZ-10柱式DNA PAGE胶回收试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］；尿素、过硫酸铵、5xTBE溶液、四甲基乙二胺（TEMED）溶液、无水乙醇、正丁醇、丙烯酰胺、N，N-亚甲双丙烯酰胺（国药集团化学试剂公司）；SYBR Gold核酸凝胶染料（赛默飞世尔科技公司）；定量滤纸（国药集团化学试剂公司）。所用试剂均为分析纯，实验用水为屈臣氏蒸馏水。
1.2实验仪器
超微量核酸浓度仪Nanodrop（赛默飞世尔科技公司）；凝胶成像仪（莫纳生物科技有限公司）；冷冻离心机（赛默飞世尔科技公司）；恒温水浴锅（杭州米欧仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）。
1.3实验方法
1.3.1制备凝胶
精确称取2.94 g尿素，向其中加入1.5 mL蒸馏水和1.4 mL的5xTBE溶液，超声3 min充分混匀后，依次加入1.75 mL的40%聚丙烯酰胺、70μL的10%过硫酸铵以及7μL的TEMED。需要注意的是，每加入一种溶液必须待混匀后再加入另一种溶液，以确保得到的溶液是均匀扩散的。将混合物快速倒入玻璃凝胶板间的空隙中，在排出板内溶液中的气泡后，将梳子插入溶液中，室温放置30 min，取出梳子，即得尿素变性PAGE。
1.3.2凝胶电泳
将样品放入95℃水浴中持续5 min，后置于4℃环境下持续5 min，取7.5μL浓度为5μmol/L的ssDNA样品与7.5μL上样缓冲液充分混匀，得到15μL尿素变性PAGE上样样品。在运行尿素变性PAGE时，将凝胶放置在1xTBE电泳池中水浴预热55℃,持续1 h，结束后排出孔中气泡，仔细将凝胶上样样品加入孔中，避免产生气泡；将加样后的凝胶在120 V电泳中运行，直到染料接近凝胶底部，停止运行。小心取出玻璃板，轻轻撬开玻璃板后取出凝胶，将凝胶放入染色液中染色45 min；染色结束后，将凝胶放入凝胶成像仪中，观察样品分布效果。
1.3.3直取法回收ssDNA
根据现有报道的方案[9]，实验制作了一种简易的直取法回收装置，如图1所示。取一个1.5 mL离心管在底部钻好孔（约3~5个），放入小块定量滤纸，并将已钻好孔的1.5 mL离心管放入另一个完好的1.5 mL离心管中，制得简单的回收过滤装置。将尿素变性PAGE凝胶上的目标片段切下放入回收过滤装置中，在12 000 r/min转速下离心5~15 min后，弃去钻孔的1.5 mL离心管，留下完好的1.5 mL离心管；定容离心管中的溶液体积，随后加入1/10体积的3mol/L醋酸钠（pH 5.2）和2倍体积的无水乙醇，在-20℃下DNA沉淀至少30 min[10]；沉淀干燥后，溶于20μL灭菌蒸馏水中。
1.3.4改良煮沸法回收ssDNA
改良煮沸法是一种简单高效的DNA回收方法，不需要有机试剂的参与[11]。从尿素变性PAGE上切下目标片段，放入1.5 mL灭菌离心管中，加50μL灭菌蒸馏水洗胶2~3次后，碎胶，加30μL灭菌蒸馏水，于100℃水浴中煮沸10 min左右，冷却后12 000 r/min离心10 min，收集上清液，置于-20℃环境中保存。
1.3.5试剂盒回收ssDNA
按照试剂盒回收方法，将目标片段从尿素变性PAGE上切下，用扩散缓冲液处理尿素变性胶中的DNA片段后置于溶液中，在其与结合缓冲液Ⅱ及异丙醇混合后，利用试剂盒嵌入的EZ旋转柱的特殊吸附膜，将DNA片段选择性地吸附到硅胶柱上，并用洗脱缓冲液洗脱，获得回收的DNA片段。
1.3.6正丁醇回收ssDNA
观察尿素变性PAGE，将目标片段切下放入1.5 mL离心管中，通过碎胶棒将目标片段捣碎，加入1 mL灭菌蒸馏水，沸水浴10 min，后10 000 r/min离心1 min，小心取出上清液，转移至15 mL离心管中。然后向上述1.5 mL离心管中加入1 mL灭菌蒸馏水，沸水浴10 min，10 000 r/min离心1 min，将上清液转移至同一支15 mL离心管中。向装有两次上清液的离心管中加入10~12 mL正丁醇，上下颠倒振荡10次混匀，9 000 r/min离心5 min，静置待溶液分层。上层是正丁醇溶液，下层是ssDNA溶液，保留下层溶液[12]。
1.3.7测定方法
ssDNA回收率及纯度测定[13]：利用Nanodrop测定回收前后样品质量浓度，通过测定溶液中A260，计算ssDNA的回收率；通过测定A260/A280，得到回收ssDNA的纯度，并再次通过凝胶电泳验证回收效果。
2结果与讨论
2.1从尿素变性PAGE中提取ssDNA的方案
本文主要分析了4种ssDNA提取方法，分别为直取法、改良煮沸法、试剂盒回收法和正丁醇回收法。图2A为5μmol/L ssDNA样品的尿素变性PAGE图。将74 nt目标片段切下，利用这4种回收方法分别提取，回收过程如图2B~E所示。直取法在过滤装置和有机试剂的辅助下，可完成对尿素变性PAGE的ssDNA回收（见图2B）。改良煮沸法回收过程仅需用到1.5 mL的离心管，通过水浴煮沸及离心，即可完成尿素变性PAGE的ssDNA回收，成本低廉，且无须用到有机试剂（见图2C）。试剂盒回收ssDNA按照相关说明书进行回收，并注意回收前要称取目标片段的重量，同时试剂盒中的各阶段缓冲液需要和目标片段的重量按比例加入（见图2D）。正丁醇回收ssDNA的过程强调在碎胶后进行沸水浴，离心，取上清液，重复2次，以使胶中的ssDNA充分溶于水中，取2次上清液后，再进行正丁醇回收（见图2E）。
2.2不同方法回收得到的ssDNA凝胶电泳结果
将尿素变性PAGE的目标片段分别经直取法、改良煮沸法、试剂盒回收法和正丁醇回收法处理后，回收得到的ssDNA。再次进行凝胶电泳的结果如图3所示。研究发现，泳道2直取法和泳道3改良煮沸法回收的ssDNA在74 nt附近有清晰的条带，说明直取法和改良煮沸法能够取得较好的回收效果，但同时条带呈现出拖尾情况，可能是因为电泳过程中的温度导致ssDNA发生迁移。因此，需要在后续实验中严格控制温度，避免拖尾的出现。用Nanodrop（见表1）测得直取法的A260/A280=1.54，回收率为46.90%；改良煮沸法的A260/A280=1.87，回收率为61.71%，表明改良煮沸法的ssDNA回收纯度较好。泳道4试剂盒回收和泳道5正丁醇回收的ssDNA在74 nt附近未呈现出清晰的条带，说明回收ssDNA的质量浓度过低。同时，用Nanodrop（见表1）测得纯度不佳，试剂盒回收的A260/A280=1.78；正丁醇回收的A260/A280=2.41，回收率都在35%左右，表明这两种回收方案的回收效果较差。为探索尿素变性PAGE回收ssDNA效果突出的方案，本文对改良煮沸法和直取法作进一步的实验优化。
2.3直取法装置优化
对影响直取法的ssDNA回收效率的实验条件进行优化，包括离心时间和过滤装置。研究发现，随着离心时间不断延长，ssDNA回收效率逐渐提高（见图4A）。当离心时间为10 min时，回收效率最高，达到53.30%，A260/A280=1.53；但当离心时间继续增加时，回收效率反而降低，可能是因为离心时间过久，更多的杂质会随着ssDNA一起析出，降低ssDNA回收效率。直取法离心5、10、15 min的A260/A280均不超过1.8，对离心时间的优化未达到纯度1.8~2的范围，回收效率也没有实现显著提高。现有研究指出，直取法得到的回收效率与过滤装置有关[14]；滤纸是回收ssDNA的有用结合材料[15]。定量滤纸过滤比棉花过滤得到的ssDNA回收效率更高，但二者的回收纯度都没有达到1.8（见图4B）。在直取法下，无论是优化离心时间还是离心装置，其A260/A280都≤1.8，说明回收的ssDNA纯度不佳。这可能是受到了醋酸钠和无水乙醇等有机试剂的影响，限制了直取法整体的回收效率。
2.4改良煮沸法实验条件优化
对影响改良煮沸法的ssDNA回收效率的实验条件进行优化，包括煮沸时间、尿素变性PAGE上样量与加水量的比值、离心时间以及初始ssDNA浓度。改良煮沸法回收ssDNA的操作简便，无有机试剂的干扰，回收得到的ssDNA的A260/A280均处于1.80~2之间（见图5），纯度较高。随着煮沸时间延长，ssDNA回收率会逐渐提高，并在10 min后逐渐趋于平缓，此时ssDNA回收率达到最高（见图5A）。尿素变性PAGE上样量为15μL，在改良煮沸法中（见图5B），当加水量为30μL时，尿素变性PAGE上样量与加水量的比值为1:2，回收效率最高。同时，离心时间对回收效率也具有较大影响[16-17]。在改良煮沸法中（见图5C），当离心时间为10 min时，回收效率最大。研究发现，如果离心时间过短，目标片段中的ssDNA会无法被全部离心出来，从而导致ssDNA回收效率低，而当离心时间过长时，不仅ssDNA会被析出，还会有其他杂质被大量析出，从而降低ssDNA回收效率。此外，初始ssDNA浓度也会影响回收效率[6]。尿素变性PAGE中，选取1、3、5和25μmol/L作初始浓度优化。结果显示，利用改良煮沸法回收尿素变性胶中的ssDNA时，对初始浓度5μmol/L的ssDNA回收效率优于初始浓度1、3和25μmol/L时的ssDNA样品（见图5D）。
实验优化结果表明，煮沸时间为10 min（见图5A）、上样量与加水量的比值为1:2（见图5B）、离心时间为10 min（见图5C）、初始ssDNA浓度为5μmol/L（见图5D）时，ssDNA的回收率最高，达到70.33%，并且ssDNA回收纯度较好（A260/A280=1.85）。
2.5与其他回收方法的回收率比较
最近报道的几种回收DNA的方法如表2所示。与其他已发表的回收方法相比，本文中的改良煮沸法成功从尿素变性PAGE中提取出了ssDNA。结果显示，本文所探究的方法具有更高的回收率，可达到70.33±0.35%，显著优于传统检测回收方法。此外，与其他方法相比，本文所提出的方法回收成本更低，且无有机试剂干扰，能快速从凝胶上提取回收ssDNA。
3总结
本文基于4种不同ssDNA回收方法（直取法、改良煮沸法、试剂盒回收法和正丁醇回收法）的对比总结，发现改良煮沸法下的ssDNA回收率最高。进一步对改良煮沸法实验条件（煮沸时间10 min、尿素变性PAGE上样量与加水量的比值1:2、离心时间10 min初始ssDNA浓度5μmol/L）进行优化后，得到的ssDNA回收率为70.33±0.35%，且具有较好的回收纯度（A260/A280=1.85）。综上所述，本文在尿素变性PAGE中探索出了一种有效提取回收ssDNA的改良煮沸法。该方案回收成本低，回收效率高，快速简便，在功能核酸的筛选及回收利用方面具有良好的实际应用前景。
参考文献
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尿素变性PAGE中ssDNA回收方法的研究与优化论文
人参与 2025-04-25 10:07:08 分类 : 理学 点这评论 作者：团论文网 来源：https://www.tuanlunwen.com/
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