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摘要：L-丙氨酸作为一种天然氨基酸，被广泛应用于食品、医药和个人护理等领域。目前，L-丙氨酸的生产主要依赖于可再生碳源的经济、绿色且可持续的微生物发酵。为提高L-丙氨酸的发酵产量，现有研究尝试了多种代谢工程策略，为降低L-丙氨酸的生产成本提供了有效途径与借鉴。基于此，文章主要对高产L-丙氨酸菌株的代谢工程改造策略和发酵关键技术进行综述，以期为后续高产L-丙氨酸微生物细胞工厂的构建提供参考。
关键词：L-丙氨酸；微生物发酵；代谢工程
L-丙氨酸作为最小的手性化合物之一，被广泛应用于食品、医药和个人护理等领域。在食品和药品领域，L-丙氨酸是美国食品和药物管理局批准的食品添加剂和营养补充剂，被普遍用作低热量甜味剂和脂肪替代品[1]。在医药领域，L-丙氨酸能够刺激体外胰岛素分泌，由L-丙氨酸制成的丙氨酸营养补充剂可帮助糖尿病患者维持健康的血糖水平[2]。此外，L-丙氨酸还具有减肥的功效，有利于改善肥胖患者的血糖控制和脂质代谢情况[3]。在个人护理领域，L-丙氨酸则被广泛用作头发和皮肤护理剂，也被用到了化妆品和某些个人护理产品的制造中[4]。此外，L-丙氨酸还是生产甲基甘氨酸二乙酸（methyl glycine diacetic acid，MGDA）的重要原料之一。MGDA是一种有效且对环境友好的新型绿色螯合剂[5]。目前，全球L-丙氨酸的年需求量大约为50 000吨[6]。
传统的L-丙氨酸生产方法主要是酶转化法。该方法以L-天冬氨酸为底物，运用具有L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的微生物，将细胞或细胞悬浮液固定化作为生物催化剂，催化后得到L-丙氨酸。该方法较为高效，可使L-丙氨酸的产率达到90%以上[7，8]。然而，酶转化法所使用的原料L-天冬氨酸，是由富马酸裂解得到的，而制备富马酸的主要原料是石油，属于不可再生资源，这大大提高了酶法生产L-丙氨酸的成本。相比于酶转化法，微生物发酵法以可再生和价格低的葡萄糖为原料，降低了L-丙氨酸的生产成本，且微生物发酵法工艺简单、反应条件温和，适用于大规模的工业化生产[6]。随着合成生物学的快速发展，微生物细胞工厂为氨基酸生产提供了重要的策略和途径。构建高产L-丙氨酸的微生物细胞工厂，成为了提高L-丙氨酸产量和降低L-丙氨酸生产成本的有效途径。文章将对L-丙氨酸生产菌株构建的代谢工程策略进行综述，包括调控主代谢途径、调节碳代谢途径、改善运输等方面，并对L-丙氨酸发酵的关键技术展开讨论。
1 L-丙氨酸的合成路径
目前，应用于L-丙氨酸工业化生产的菌株主要包括大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌。其中，大肠杆菌遗传背景清晰，且对外源引入的基因具有良好兼容性，是L-丙氨酸发酵生产的重要平台微生物之一，在L-丙氨酸的工业化生产中发挥着举足轻重的作用。在大肠杆菌中，大肠杆菌本源的谷丙转氨酶可催化丙酮酸和谷氨酸转氨生成L-丙氨酸，但该反应效率较低，并不适用于L-丙氨酸的大规模生产。现阶段，利用NADH连接的丙氨酸脱氢酶将丙酮酸转化为L-丙氨酸，是在大肠杆菌中构建L-丙氨酸异源合成路径的主要方式。在大肠杆菌中，葡萄糖（glucose）经过磷酸转移酶系统（phosphotransferase system，PTS）进入细胞，再经由糖酵解途径（glycolytic pathway，EMP）被转化为L-丙氨酸合成的前体丙酮酸（pyru-vate）；异源引入的丙氨酸脱氢酶可高效催化丙酮酸、NH4+和NADH，使其生成L-丙氨酸，同时胞内生成的L-丙氨酸又经由L-丙氨酸外运蛋白AlaE被转运至胞外。具体如图1所示。2 L-丙氨酸生物合成的代谢工程改造策略
2.1丙氨酸脱氢酶的筛选与改造
对于微生物代谢工程，强化主要代谢途径是过量生产有价值目标化合物最重要的策略之一[9]。在天然的大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌中，L-丙氨酸的生产仅供细胞所需，只有经过某种方式的代谢工程改造，才能实现L-丙氨酸的过量生产。L-丙氨酸的合成路径相对较短。其中，丙氨酸脱氢酶是L-丙氨酸生产过程中的关键酶，可将前体丙酮酸转化生成L-丙氨酸。因此，筛选来源合适的丙氨酸脱氢酶，是构建L-丙氨酸异源合成路径的第一步。为筛选高效的丙氨酸脱氢酶，吴晨等[10]在谷氨酸棒杆菌中分别过表达了来源于需钠弧菌、枯草芽孢杆菌、格氏嗜盐碱杆菌和干酪乳杆菌的丙氨酸脱氢酶基因，并发现来源于枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶能够有效促进丙酮酸向L-丙氨酸转化，使L-丙氨酸产量达到了60 g/L。此外，酶改造也是提高酶活的一种有效策略。张学礼等[11]利用随机突变，筛选出了一种高活性的丙氨酸脱氢酶突变体（327位的赖氨酸突变为天冬酰胺），使丙氨酸脱氢酶的酶活提高了90%，L-丙氨酸产量提高了88.2%。为提高异源丙氨酸脱氢酶基因在大肠杆菌染色体上的表达效率，张仲良等[12]对丙氨酸脱氢酶基因展开了密码子偏好优化，并实施了全长人工合成策略，最终得到了人工合成的丙氨酸脱氢酶基因，使制备的丙氨酸脱氢酶基因更符合大肠杆菌的密码子偏好、优化得到的丙氨酸脱氢酶酶活提高了85%、L-丙氨酸产量提高了47.3%。
2.2强化前体丙酮酸供应
丙酮酸是糖酵解路径的终产物，也是L-丙氨酸合成的重要前体。强化丙酮酸的供应，以使更多碳流向L-丙氨酸的合成过程，是实现L-丙氨酸过量生产的重要策略。强化前体丙酮酸供应共有“通”和“堵”两种方式。其中，“通”指强化丙酮酸的合成路径，以促进更多葡萄糖转化为丙酮酸。为解决葡萄糖消耗迟缓问题，Toru等[13]在谷氨酸棒杆菌ΔldhAΔppc+alaD中同源过表达了糖酵解路径中编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的gapA基因，并发现过表达的gapA基因可在缺氧条件下刺激葡萄糖消耗，从而提高丙氨酸产量；在此基础上，其又逐步过表达了糖酵解路径的pyk（编码丙酮酸激酶）、pfk（编码磷酸果糖激酶）和gpi（编码葡萄糖-6-磷酸异构酶）[14]，并发现经过每个过表达步骤后，L-丙氨酸的产量和转化率均有所提高，说明强化糖酵解路径有利于提高葡萄糖利用率，降低生产成本。除了EMP途径，葡萄糖还可通过Entner-Doudoroff（ED）途径生成丙酮酸，而这种ED途径为微生物所特有，主要存在于一些缺乏完整EMP途径的微生物中，可用作EMP的替代途径，使葡萄糖只需4步即可快速生成丙酮酸。赵桂红等[15]在谷氨酸棒杆菌中引入了大肠杆菌来源的ED途径关键酶基因edd（编码6-磷酸葡糖酸脱水酶）和eda（编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶），有效提高了L-丙氨酸的产量。“堵”指阻断丙酮酸向其他代谢途径流入。L-丙氨酸的发酵生产过程往往伴随副产物的生成，尤其是以丙酮酸为前体的甲酸、乙酸、乳酸等副产物。副产物的积累不仅会造成碳源浪费，降低L-丙氨酸转化率，还会极大程度地阻碍后期L-丙氨酸的提取纯化工作。具体而言，发酵过程中乙酸积累会抑制大肠杆菌细胞生长，当乙酸积累量达到2 g/L以上时，就会对菌体生长产生明显抑制效果[16]。大肠杆菌中乙酸的合成途径有两条：第一条是乙酰磷酸途径，表现为乙酰辅酶A先经过磷酸乙酰基转移酶（Pta）催化生成乙酰磷酸，再经过乙酸激酶（AckA）催化生成乙酸[17]；第二条是丙酮酸氧化酶途径，指丙酮酸在丙酮酸氧化酶（PoxB）催化作用下生成乙酸[18]。周丽等[19]敲除了野生型大肠杆菌菌株B0016的pta、ackA和ldhA基因，使乙酸积累量降低了77.5%，乳酸积累量为0，丙酮酸积累率为23.8 g/L；在引入丙氨酸脱氢酶后，L-丙氨酸产量达到了59.4 g/L。
2.3减轻L-丙氨酸对菌体的胁迫
研究发现，培养基中添加终质量分数为1 g/L的L-丙氨酸能够显著降低大肠杆菌的比生长速率，从而减缓发酵过程中L-丙氨酸的合成速率。此外，L-丙氨酸在细胞内大量积累，也会对细胞造成损伤。为解决L-丙氨酸抑制菌体生长的问题，周丽等[19]利用温度调节基因开关(λpR-pL）对大肠杆菌的菌体生长和L-丙氨酸合成过程进行了动态调控，使菌体生长和产物生产解耦连，将L-丙氨酸产量提高到了67.2 g/L。L-丙氨酸的有效外排，已被证明可降低细胞内的L-丙氨酸水平，保护细胞不因L-丙氨酸及其衍生物毒性水平积累而受损[20]。大肠杆菌胞内生成的L-丙氨酸可经由L-丙氨酸外运蛋白AlaE被转运至胞外[21]。通过加强L-丙氨酸转运系统，可将L-丙氨酸及时转运至胞外，防止胞内L-丙氨酸积累过多，从而影响到大肠杆菌的生理代谢。齐俊平等[22]运用启动子优化策略，在编码AlaE蛋白的alaE基因上游加入了组成型的J23119启动子，强化了AlaE蛋白的表达，将L-丙氨酸产量提高了32.4%。近年来，基于启动子工程策略对微生物启动子进行挖掘和改造，以使其响应不同的物理、化学信号，实现目标基因的精细化、动态化调控，已成为合成生物学的研究热点[23]。目前，已有研究开发了响应L-丙氨酸的启动子元件。后续，还需要开发基因L-丙氨酸响应的动态调控系统，以解决L-丙氨酸在发酵前期抑制菌体生长的问题[24]。
3 L-丙氨酸的发酵关键技术
3.1发酵培养基组分
选用合适的发酵培养基，在发酵工业领域尤为重要。大肠杆菌发酵培养基一般由碳源、氮源和无机盐等组分组成，而微生物发酵生产L-丙氨酸最常用的碳源就是葡萄糖，具有可再生和价格低廉的优势，且易被大肠杆菌利用。也有研究将甘油作为唯一碳源发酵合成L-丙氨酸。甘油是脂肪酸工业和生物柴油制造工业的副产物，以甘油为原料发酵生产L-丙氨酸，能有效降低生产成本，减轻生物柴油制造业处理副产废物的压力。此外，甘油代谢还会产生更多NADH，有利于L-丙氨酸合成[25]。氮源分为有机氮源和无机氮源。在L-丙氨酸发酵培养基中添加有机氮源，如酵母粉、蛋白胨等，能够促进菌体生长，从而获得更高的生物量；L-丙氨酸发酵培养基中常用的无机氮源包括NH4Cl、（NH4）2SO4和氨水。无机氮源为速效氮源，不仅有利于菌体前期快速生长，还可为L-丙氨酸合成提供NH4+。在大规模的发酵生产中添加氨水，能够在提供NH4+的同时，中和酸性产物，从而维持发酵液pH的稳定性。L-丙氨酸发酵培养基中添加的无机盐有MgSO4、K2HPO4和Na2HPO4等，不仅可为菌株提供镁、磷和硫等元素，也可作为辅助因子为大肠杆菌所利用。
3.2发酵过程控制
大肠杆菌是兼性厌氧菌，在有氧和无氧条件下均可通过糖酵解反应催化葡萄糖合成丙酮酸。然而，在有氧条件下，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的催化下会形成乙酰辅酶A，并进入TCA循环中。这一过程会消耗丙酮酸，导致进入L-丙氨酸的碳通量减少，L-丙氨酸的转化率降低。因此，L-丙氨酸的生产通常采用两阶段发酵的方式进行，即在发酵前期采用有氧发酵，使丙酮酸进入TCA循环，产生能量供细胞生长，而当积累到足够的生物量后，便会关闭通气同时降低转速，转化为厌氧发酵。此时几乎没有碳通量经过TCA循环，大部分碳通量可用于L-丙氨酸合成，而不是被消耗在细胞代谢中，从而促进L-丙氨酸产量和转化率的提高。Zhou等[26]采用两阶段发酵方式发酵生产L-丙氨酸，并发现在有氧培养11 h后转变为厌氧发酵，发酵周期为40 h，L-丙氨酸产量达到了120.8 g/L；厌氧阶段L-丙氨酸的转化率达到96%（理论转化率为98.9%）。由此可见，厌氧发酵无需通氧、操作简单，且L-丙氨酸转化率高，降低了发酵过程中的能耗成本，具有广阔的应用前景。
4结论
文章综述了基于系统代谢工程构建高效生产L-丙氨酸微生物细胞工厂的有效策略，包括调控主代谢途径、调节碳代谢途径、增强L-丙氨酸运输系统。同时，探讨了L-丙氨酸工业化生产的关键发酵技术，即厌氧发酵，并指出该技术能有效提高L-丙氨酸的转化率，节约生产成本。需要注意的是，系统代谢工程策略虽然显著提高了L-丙氨酸的产量，但仍存在不容忽视的问题：一方面，发酵周期长，增加了材料、劳动力和能源消耗等方面的总成本；另一方面，发酵后期L-丙氨酸的积累抑制了细胞活性，削弱了L-丙氨酸的生产能力[27]。因此，L-丙氨酸的生物合成与代谢机制还需进行更加深入的探索，同时其调控方法也需依靠更先进、合理的工具和策略，以构建高效、节能的微生物细胞工厂。
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微生物发酵法生产L-丙氨酸的研究进展论文
人参与 2025-03-19 10:22:46 分类 : 理学 点这评论 作者：团论文网 来源：https://www.tuanlunwen.com/
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