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摘要：文章按照GB 8538-2016鉴定标准对水中铜绿假单胞菌超标的样品进行检验，基于微生物在不同培养基上具有不同的形态特征，通过对营养琼脂、CN琼脂、乙酰胺培养基、RAPID’s P.aeruginosa Agar4种培养基上不同水样中的铜绿假单胞超标样品进行检验，同时结合LAMP分子法和VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定结果，对不同检测技术、方法进行比较分析。对比发现，LAMP分子法能够在准确检测出铜绿假单胞菌的基础上减少检测时间，不仅优化了微生物实验室病原菌检测方法，而且还提升了铜绿假单胞菌的检测效率。
关键词：铜绿假单胞菌；环介导等温扩增；检测
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）也被称为绿脓杆菌，是一种条件致病菌[1]，在自然环境中分布广泛，属于革兰氏阴性杆菌。铜绿假单胞菌是专性需氧菌，菌落整体一般呈扁平状，较为湿润[2]。铜绿假单胞菌的检测方法很多，有培养计数法、标滤膜法、选择培养基分离培养、生化鉴定、LAMP检测、实时荧光定量PCR检测等[3]。其中，培养计数法实用性强且准确度高，应用较多，但由于微生物的培养时间通常需要2~4 d，检测时间较长。环介导等温扩增（LAMP）是一种新型核酸等温扩增技术[4-5]，相较于传统的核酸检测技术，只需使用一种酶，操作简单，在微生物领域展现出了巨大的应用潜力[6]。
本文采用传统的国标检测法，基于微生物在不同培养基上具有不同形态特征这一特性，比较营养琼脂、CN琼脂、乙酰胺培养基、RAPID’s P.aeruginosa Agar 4种培养基上待测菌的菌落形态，同时结合LAMP分子法和VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定结果，对不同检测技术和方法进行比较分析。结果发现，LAMP分子法具有明显优势，不仅可以优化微生物实验室病原菌检测方法，还可以缩短铜绿假单胞菌的检测周期，节省检测过程中的人力和物力消耗，具有突出的经济效益。
1实验器材与试剂
1.1仪器与设备
水浴锅（HH-6常州国华电器有限公司）；电热恒温培养箱（DHP-9270山东博科科学仪器有限公司）；VITEK微生物检定仪（VITEK2 Compact）。
1.2实验试剂
营养琼脂；CN琼脂；乙酰胺培养基（北京陆桥技术股份有限公司）；RAPID’s P.aeruginosa Agar；BHI培养基（上海欣中生物工程有限公司）；革兰氏染色试剂（北京陆桥技术股份有限公司）；铜绿假单胞菌核酸检测试剂盒（广州华峰生物科技有限公司）。
1.3实验材料
水样：超纯水（空白对照）；实验室自来水；直饮水；家庭用水；生产用水。
菌种：铜绿假单胞菌标准菌株ATCC15442；恶臭假单胞菌标准菌株CICC 20576。
2实验方法
2.1培养基特异性比较
2.1.1样品制备与增菌培养
样品制备：依据GB 8538-2016鉴定标准中的第57项要求采集样品。具体步骤如下：将250 mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤，并将滤膜置于CN琼脂上36℃培养24 h，然后将可疑菌落划线接种于营养琼脂培养基上进行分离纯化，36℃培养24 h。
增菌培养：将铜绿假单胞菌标准菌株ATCC15442和恶臭假单胞菌标准菌株CICC 20576接种到BHI培养基中进行活化，36℃培养过夜。
2.1.2培养实验
对大桶水中检测到的铜绿假单胞疑似阳性菌株及标准菌株进行生化实验，并将其分别划线接种在营养琼脂、CN琼脂、乙酰胺培养基、RAPID’s P.aeruginosa Agar 4种培养基上，36℃培养24 h。比较试验菌株在4种培养基上的菌落形态。
2.2 VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定
将菌株进行革兰氏染色，并根据菌株形态和染色结果选择相应的鉴定卡。挑取待测菌株单菌落制备菌悬液，采用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统对其进行鉴定。
2.3铜绿假单胞菌LAMP检测方法
挑取2.1.1中培养得到的可疑菌落进行LAMP检测，以恶臭假单胞菌标准菌株CICC 20576为干扰菌。采用煮沸法提取DNA。LAMP扩增根据华峰生物公司的铜绿假单胞菌LAMP试剂盒说明书进行。
3结果与分析
3.1培养基特异性比较
从桶装饮用水中检测到一株铜绿假单胞疑似阳性菌株，将其编号为47；其余样品上均无菌落生长。菌株47在CN平板上呈黄色，产荧光；在营养琼脂和乙酰胺培养基上均为淡黄色菌落；在RAPID’s P.aeruginosa Agar上为深绿色菌落，与标准菌株形态一致。根据GB 8538-2016鉴定标准，进行产氨实验和42℃生长实验，结果均呈阳性，判定为铜绿假单胞菌。恶臭假单胞菌在CN琼脂上为淡黄色菌落，不产荧光；在营养琼脂上为淡黄色菌落；在乙酰胺和RAPID’s P.aeruginosa Agar培养基上不生长。产氨实验和42℃生长实验的结果均呈阴性。
3.2 VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定结果
根据革兰氏染色结果，菌株47、标准菌株ATCC15442均为革兰氏阴性菌。选择相应的鉴定卡对分离纯化得到的菌株采用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统进行鉴定，结果如表1所示。菌株47为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），且鉴定结果的可能性为97%。鉴定结果与GB 8538-2016鉴定标准规定的方法中阳性菌株的特性一致。
3.3铜绿假单胞菌LAMP检测结果
对分离纯化培养后的菌株47和标准菌株进行DNA模板制备，并通过LAMP检测方法对其进行检测。结果显示，菌株47及标准菌株ATCC15442的显色反应均为黄绿色，与阳性结果一致，而干扰菌CICC 20576的显色反应为黄色，结果为阴性。具体见图1。可见，LAMP方法可以对可疑菌落进行直接检测，与VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统相比，省去了分离纯化的步骤，缩短了检验周期。
4讨论
目前，对于铜绿假单胞菌的检测主要依靠传统的培养计数法，虽然准确性较高，但存在操作复杂、培养周期长、生化鉴定步骤多等问题，同时还有可能造成污染。从CN平板上挑取可疑目标菌落进行分离纯化，传统分离纯化需要继续培养1~2 d，而LAMP法则不需要进行后续的纯化培养，一定程度上减少了检验时间，缩短了检验周期[7]。与VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统不同，LAMP法不需要昂贵的仪器设备，只需要进行简单的前期增菌培养，操作简便，不需要学习复杂的技术。综上，LAMP检测法能够简化操作步骤、缩短检验周期，在微生物检验方面具有显著优势。其优化了微生物检测方法，能够对水中的铜绿假单胞菌进行快速有效地检测。
参考文献
［1］赵端阳,阎学燕,陈磊.不同方法鉴定包装饮用水中铜绿假单胞菌含量比较分析［J］.疾病监测与控制,2021,15(5):352-354.
［2］王莉莉.滤膜法和Pseudalert酶底物法检测饮用水中铜绿假单胞菌的比较［J］.生物化工,2022,8(1):104-106.
［3］郭焜鹏,何娟,张海韵,等.包装饮用水中铜绿假单胞菌的污染情况分析［J］.食品安全导刊,2022(31):50-52.
［4］姚丽锋,冯家望,张娟,等.重组酶介导等温扩增法检测食品中铜绿假单胞菌［J］.食品安全质量检测学报,2022,13(17):5695-5701.
［5］武爱荣,杨乐.VITEK-2 Compact检测奇异变形杆菌、摩根摩根菌、铜绿假单胞菌的部分药敏结果准确性评价［J］.现代检验医学杂志,2020,35(6):106.
［6］李羽翡,祖新,李**,等.铜绿假单胞菌LAMP快速检测方法建立及微滴数字PCR验证［J］.食品工业科技,2020,41(11):267-272,293.
［7］单萌,周婀,马瑜.铜绿假单胞菌快速检测方法的优化研究［J］.食品安全导刊,2021(31):50-55,62.后台-系统设置-扩展变量-手机广告位-内容正文底部 -
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铜绿假单胞菌检测方法的比较分析与优化论文
人参与 2025-03-19 10:15:28 分类 : 理学 点这评论 作者：团论文网 来源：https://www.tuanlunwen.com/
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