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摘要：目的：利用不同配比聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），采用双乳化法，将异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白（BSA-FITC）包封制成微球；考察PLGA共聚物比例和相对分子质量对微球平均粒径、包封效率和释放方式的影响。方法：将异硫氰酸荧光素标记的牛血清蛋白溶解在乙酸乙酯中，超声波频率28 kHz，功率40 W，超声波作用时间5 min，以形成水/油乳液；将初级乳液快速转移到含聚乙烯醇的水性介质，通过两次乳化处理后，得到微球；计算产品收率、封装效率、微球粒度分布和释放量。结果：异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白包埋在聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球中，当共聚物聚乳酸与羟基乙酸质量比为75∶25（MW 40~75 kDa）时，具有最高的产品收率和封装效率，分别为51.04％和100％；通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白释放结果，释放量低于25%。结论：PLGA可作为生物药品的包封材料。
关键词：异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白，聚乳酸-羟基乙酸共聚物，双乳化法，微囊化
生物技术药物的研究和开发已经成为医药产业中一个重要的领域，多肽与蛋白质药物由于能迅速被胃肠道消化酶降解破坏临床应用受到较大限制”，必须改进生物制剂的配制和传递因，微素化是实现控制释放以及调节体内药物水平及其停留时间的一种有效途径。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)具有良好的成膜、成球性能，良好的生物相容性以及生物降解性，通过水包油包水(W/O/W)双乳化法可以有效地截留部分水溶性药物，作为载体用于蛋白质药物制剂制备及应用研究。本文以牛血清蛋白(BSA)为模型蛋白，探讨PLGA相对分子质量和共聚物比例对微球粒径、包封效率和释放方式的影响，以及混合频率和持续时间等工艺参数对微球粒径和多分散性的影响，
1.实验材料
1.1实验试剂
PLGA，共聚物比例分别为50/50、75/25、65/35[聚乳酸/羟基乙酸(%)]，相对分子质量为40~75kDa(Ref.P2066-5G)，美国Sigma公司；FITC-BSA(Ref.A9771-250MG：Mini-PROTEAN*TGXTM凝胶；PVA、PBS和EA，由医化学院药物合成实验室提供。
1.2实验仪器
PageRulerTM预染色NIR蛋白阶梯，ThermoScientifc；Eppendorf 5804离心机，艾本德中国有限责任公司；F-97XP荧光分光光度计，上海棱光科学器材有限公司；尼康显微镜(×10)；Malvern Mastersizer；荧光计PerkinElmerEnVision；MS2 Minishaker IKA；79HW-1型恒温磁力搅拌器，上海维城仪器有限公司
2实验方法
2.1VW/O/W双乳化法制备不同剂型牛血清蛋白聚乳
酸-羟基乙酸共聚物微球称取不同剂型PLGA各304.3mg，分别溶解在3mL乙酸乙酯(EA)中，室温磁力搅拌均匀，制备不同剂型PLGA溶液；取6份0.5 mL 94 g/LFITC-BSA溶液分别加入到不同剂型PLGA溶液中。分别将上述6份混合液快速转移到含稳定剂1%(体积分数)聚乙烯醇(PVA)的水性介质中，即产生次级乳液；超声处理(超声波频率在28、45、80kHz 3档可调，功率在40、60、80、100W4档可调，超声波作用时间控制在5~10 min，温度为室温)，快速摇动初级乳液(W1/O)该乳液在PVA中被二次亲水乳化、将双重乳液室温下磁力搅拌1h以加速PVA蒸发，从而形成硬化的微球。将微球通过100pm筛网过滤，并用双蒸馏水洗涤以除去盐。
最后，将微球在干冰中冷冻，并在冷冻干燥机中再次干燥2hg放入冰箱中保存。用Nanomeasure1.2粒径分布软件统计200个微球直径，计算平均值和粒径分布范围。双乳化法对牛血清蛋白微妻化过程见图1，不同剂型共聚物质量分数和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的相对分子质量见表1。
2.2微球表征
通过荧光计测定来确定FITC-BSA的包封效率和释放量。选择495 nm波长进行FITC-BSA检测。
2.2.1计算产品产星和封装效率
将约30mg微球溶于EA，并用双蒸馏水萃取、通过荧光计在495 nm下测量水相中FITC-BSA的量。产品产量计算见式（1）、式（2）：
式中：WFITC-BSA为FITC-BSA起始质量，mg；WP为PLGA起始质量，mg。
式中：W为微囊化后装载在基于PLGA聚合物的基质上的FITC-BSA的量，mg；ρ为溶解在水性介质中的FITC-BSA的质量浓度；V为水性介质的体积。
封装效率和产率计算见式（3）、式（4）：
式中：WFD冷冻干燥后微球的质量。处理效率见式（5）：
处理效率=封装效率×产率×100%.（5）
2.2.2微球释放BSA量
精确称重微球（30 mg），然后将其悬浮在8 mL磷酸盐缓冲液中。释放实验在37℃、2 000 r/min下进行。在给定的时间段（0、1、2 h和2周）内分析样品，以评估使用荧光方法释放的BSA的量（实验一式三份）。
2.2.3粒度分布分析
通过光学显微镜评价冷冻干燥的微粒的形态。根据D10、D50、D90和SPAN的值[计算见式（6）]分析了微球的多分散性。术语D10、D50、D90分别表示最大微球直径小于样品体积的10％，最大微球直径小于样品体积的50％和最大微球直径小于样品体积的90％。
2.2.4 FITC-BSA的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
通过SDS-PAGE分析微球中FITC-BSA的完整性和稳定性[8]。从PLGA微球释放的FITC-BSA是从样品的上清液的水部分中获得的，用于2周的释放测量。上清液样品在离心旋转过滤器（10 kDa MWCO）中进行浓缩。释放的FITC-BSA和标准样品，与LDS上样缓冲液溶解，在95℃下沸腾10 min以促进变性，然后将其上样到聚丙烯酰胺凝胶上，并在185 V下电泳55 min。凝胶用考马斯蓝染色。
3结果与讨论
3.1建立校正曲线FITC-BSA
由于FITC-BSA的质量浓度范围从0.156 25 mg/mL到2.5 mg/mL太高，超出了荧光测定法的检测限（LOD），因此相对结果无效。数据之间存在线性关系，表明数据是精确的（图2）。
3.2微球尺寸和微球分布
冷冻干燥的微球为具有光滑表面的球形（图3）。主要微球尺寸范围为22.63~32μm。
SPAN是指FIT-BSA负载的PLGA微球尺寸分布的宽度，直径分布更均匀，SPAN的值较小。制剂5的尺寸均一性不是理想的（图4）。微球直径和多分散性的控制对于控释BSA的传递具有重要意义。理想的球体尺寸可提供所需的释放速率。
有机溶剂在水层中的溶解度有助于EA和PVA之间的大量质量移动，减少了微球沉淀所需的时间，从而使微球更小。因此，EA/MeOH的混合物可用于制备外部水层，以改善水溶性，从而导致较小的微球尺寸[5]。在外相中PVA的存在有助于液滴的稳定，防止了聚结现象的产生。因此，较高浓度的PVA会产生较小的微球[6]。另外，用于第一种乳液的较高的超声处理频率有利于液滴分裂，从而产生较小的微球[7]。此外，为了获得均匀的尺寸分布，必须对多分散微球进行过滤或筛分[8]。
高浓度的PLGA可导致高微球的单分散性，因为它可以促进PLGA沉淀并防止微球聚集[8]。另外，可以通过将PLGA溶液喷过一个小孔以形成射流来制造单分散的微球。同时，应在PLGA喷嘴周围采用非溶剂相的循环流[9]。
3.3从PLGA微球中回收BSA
实际载荷的两个值之间的差异可能源于以下因素：首先，FITC-BSA吸附在外部水层的表面上；第二，将pH控制在7以下，以使FITC-BSA变性。因此，荧光容量将降低。
作为水溶性生物药物，BSA将更溶于乙醇酸比率较高的聚合物中。在此，可以通过增加乙醇酸的量的方法来提高封装效率。
高分子量和高亲水性提高了药物的包封效率[10]。图5中给出了BSA收率和包埋在PLGA中的BSA的包封效率，由图5可以看出，6种剂型BSA的收率为81%~100%，当共聚物聚乳酸与羟基乙酸质量比为75:25（MW 40~75 kDa）时，具有最高的产品收率和包封效率，分别为100％和51.04％。较低的实际负载量可确保较高的封装效率，从而削弱了相对分子质量和亲水性的重要性。另外，较大体积的内部水相或EA的二氯甲烷替代品有利于封装效率。由于二氯甲烷的挥发性更大，水溶性更差，因此有助于在较高的蒸发速度下增加PLGA的沉淀和微球的形成[10]。而且，更短的超声处理周期和更低的频率导致略微更高的封装效率[10]，本实验最终选用的超声波频率为28 kHz，功率40 W，超声波作用时间5 min。与文献[10]相符。
3.4 BSA释放行为
3.4.1双相释放
PLGA生物降解的结果表明，BSA释放的双相曲线显示出图6的模式。一旦将控释制剂置于释放环境中，初始量的药物就会以不稳定的速度释放。突发释放是不可预测的，并且突发数量不受控制[4]。突发释放的重要性值得更加重视。一方面，有些药物需要以不同的速率给药，因此突释是有用的。另一方面，最初的高释放速度不仅可能导致毒性水平的接近甚至最高，而且在此阶段，负载的药物也会被代谢，导致经济浪费。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白释放结果，释放量低于25%。
3.4.2影响释放曲线的因素
3.4.2.1剂型共聚物组成的影响
乙醇酸部分在决定影响释放曲线的聚合物基质的亲水性和降解速度方面起着重要作用[10]。从理论上讲，由于较高的亲水性，乙醇酸质量比的增加显示出较快的释放速率，结果，PLGA质量比75:25的释放速度比PLGA质量比65:35的释放慢。
3.4.2.2相对分子质量的影响
高相对分子质量的聚合物显示较低的释放速率。聚合物链的大小与相对分子质量有关，因此相对分子质量较高的聚合物往往具有更多的分支，需要更长的释放时间。
3.4.2.3微球尺寸的影响
较小的微球将以更快的速度释放。可以出于以下原因解释不同配方的释放曲线。与包裹在PLGA单体比例75:25中的FITC-BSA相对分子质量相比，包裹在PLGA单体比例50:50中的FITC-BSA的释放速率未达到最快的结果，这是因为相对分子质量较大，并且包裹效率不足。尽管与PLGA质量比75:25相比，PLGA质量比65:35中的乙醇酸质量分数更高，但相对分子质量最高，因此释放速率最低。因此，相对分子质量被认为是影响释放速率的主要因素。尽管截留在PLGA质量比75:25中的微球尺寸最大，但相对分子质量最低。因此，这种配方释放最快。
可以通过提高亲水性更高的乙醇酸含量以及选择较低的质量的聚合物来实现从PLGA微球释放BSA的加速。另外，在升高的释放温度和酸性条件下，释放速率可能会提高。
3.5装入PLGA微球的FITC-BSA的稳定性和完整性
条带的颜色强度与FITC-BSA的浓度有关（图7）。因此，样品带模糊可解释为释放的FITC-BSA量少。SDS-PAGE可解释搅拌和制备程序是否会改变BSA结构。结果也可以暗示BSA是通过化学还是物理方式与PLGA相互作用。另外，涉及EA的封装方法导致BSA不可逆的聚集，释放结果表明仅释放了少量的FITC-BSA。4结论
结果表明，PLGA可作为生物药品的包封材料，PLGA作为生物相容性聚合物基质可以使BSA负载并具有高封装效率。PLGA共聚物比例和相对分子质量对微球平均粒径、包封效率和释放方式都有一定的影响；通过凝胶电泳分析异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白释放，高相对分子质量的聚合物显示较低的释放速率。
参考文献
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聚乳酸-羟基乙酸共聚物对牛血清蛋白微囊化和微球表征论文
人参与 2024-11-14 10:32:31 分类 : 理学 点这评论 作者：团论文网 来源：https://www.tuanlunwen.com/
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