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摘要：目的探究CeNPs（纳米氧化铈）在DOX（阿霉素）诱导的心肌细胞损伤中的作用，以及CeNPs对DOX心肌细胞损伤中SOD活性的影响。方法实验使用H9C2大鼠心肌细胞，DOX处理建立损伤模型，并将细胞随机分为5组：空白对照组、DOX损伤组、CeNPs组、DOX+CeNPs组、DOX+DEX（右丙亚胺，阳性保护药）组进行实验。通过CCK-8法测定存活率、Western Blot法测定蛋白表达量、生化法检测氧化应激指标SOD活性。结果CCK-8法：DOX+CeNPs组相对于DOX组，细胞存活率显著增高（P<0.0001）。Western Blot法：DOX+CeNPs组与DOX组对比，Bax蛋白表达水平下降（P<0.0001），Bcl-2蛋白表达水平增高（P<0.05）。生化法检测：DOX+CeNPs组与DOX组对比，SOD活力升高（P<0.05）。结论CeNPs能够提高DOX处理后的细胞存活率；CeNPs调控相关凋亡蛋白的表达减轻DOX处理后的细胞凋亡；CeNPs通过提高SOD活性改善DOX处理后的细胞氧化应激失平衡。
关键词：阿霉素心肌损伤；纳米氧化铈；SOD；氧化应激
0引言
阿霉素（Doxorubicin，DOX）是1950年偶然从土壤细菌链霉菌中分离出来的一种化疗药物。20世纪60年代，DOX被证实对白血病和淋巴瘤有显著的疗效，目前仍为治疗实体瘤（如卵巢癌、乳腺癌和胃肠道癌症）首选。这种抗癌药物有各种副作用，如过敏反应、心脏损伤、脱发、骨髓抑制、呕吐和膀胱刺激，DOX最危险的副作用是心脏毒性，此毒性具有剂量依赖性、长期性、和潜在的致命性，临床表现为低血压、心动过速、心律失常和最终的充血性心力衰竭（congestive heart failure,CHF），后者是最严重和剂量限制性的不良事件，严重影响肿瘤幸存患者的生存质量和生存率。虽然大多数癌症患者通过化疗完全康复后能够正常生活，但是一些患者在接受DOX化疗后15~20年才可能出现心脏并发症，例如气短、胸痛和其他心血管功能障碍的症状。因此，在DOX化疗中采取预防性保护措施尤为关键[1-2]。
纳米氧化铈（cerium oxide nanoparticles，CeNPs）是一种氧化铈的纳米材料，其晶粒尺寸通常在1~100nm。它具有优异的物理、化学和光学性能，被广泛应用于催化、储氧、能源、环境、生物和磁性等领域，由于其出色的特性，可用于包括抗氧化、抗炎、抗菌、血管生成和抗凋亡活性，是最有希望的生物医学候选材料之一。SOD是一组金属酶，作为对抗活性氧（reactive oxygen species，ROS）介导损伤的第一道防线，SOD有望在治疗氧化应激相关疾病中发挥重要作用。研究发现，CeNPs通过表面氧空位状态的改变，Ce4+与Ce3+在氧化还原反应过程中能够互相转化，可以模仿SOD活性[3-4]。
为了研究CeNPs在DOX诱导的心脏毒性中的作用，本实验通过H9C2大鼠心肌细胞建立DOX损伤模型，使用CeNPs与DOX联合共处理心肌细胞。通过评估细胞活力、凋亡与抗凋亡蛋白的表达、氧化应激指标T-SOD活力，来探讨CeNPs在DOX诱导的心肌细胞损伤中的作用及机制，为减轻DOX诱导的心肌细胞损伤提供新的药物治疗方法。
1材料与方法
1.1主要试剂与材料
H9C2大鼠心肌细胞株（武汉普诺赛生命科技有限公司）；CeNPs（Sigma）；盐酸阿霉素（上海源叶生物科技有限公司）；右丙亚胺盐酸盐（上海源叶生物科技有限公司）；H9C2细胞专用培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司，）；CCK-8试剂盒（Biosharp）；MDA检测试剂盒（碧云天）；LDH检测试剂盒（南京建成）；T-SOD检测试剂盒（南京建成）；Bax抗体（signalway antibody）；Bcl-2抗体（signalway antibody）；细胞培养箱（Thermo Scientific）；酶标仪（BioTEK）；超声波清洗机（宁波市鄞州硕力仪器有限公司）。
1.2方法
1.2.1培养H9C2心肌细胞
将H9C2大鼠心肌细胞置于培养瓶中，加入适量完全培养基后置于37℃和21%O2，5%CO2无菌培养箱内，每隔12h观察细胞形态及贴壁情况，一般培养周期2~3d，取处于对数生长期，长至80%~90%的H9C2心肌细胞，进行细胞传代或后续实验所用。
1.2.2分组
选取生长贴壁良好，长至80%~90%的H9C2心肌细胞，随机分为5组：正常对照组（24h）；DOX损伤组（24h）；CeNPs组（24h）；CeNPs+DOX共处理组（24h）、DOX+DEX共处理组（24h）。本实验所用DOX浓度均为1μM DOX（根据查阅文献及前期预实验发现此浓度下细胞存活率在50%左右）；CeNPs选取浓度为10μg/mL，加药前使用超声清理机振荡，充分分散避免团聚现象影响结果；注意处理组提前按1∶1比例体积稀释配置，使DOX和CeNPs浓度一致。
1.2.3 CCK-8检测活力
①取生长贴壁良好的细胞，按照实验方案及分组要求，向96孔板加入含不同浓度待测药物的培养基100μL，然后置于培养箱孵育24h。
②为避免药物继续作用干扰结果，弃掉各组原有液体，加入100μL培养基+10μL CCK-8试剂，2h后置于酶标仪在450nm处测定OD值。③计算细胞活力（%）公式=细胞活力=（药物处理组OD值-空白组OD值）/（细胞对照组OD值-空白组OD值）×100%。
1.2.4 Western Blot测定凋亡相关蛋白表达
用PBS洗涤细胞，加入裂解液并枪吹，混合裂解液。离心收集上清，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白质浓度。混合上清和缓冲液，加热5分钟。用SDS-PAGE分离蛋白质，转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜浸泡在5%脱脂奶粉中封闭1小时。使用稀释的一抗和膜在4℃下孵育过夜。使用稀释的二抗和膜在室温下孵育2h。用ECL反应液涂覆膜并在凝胶成像仪中进行曝光和采集图像。使用ImageJ图像分析软件，把目的条带/内参条带灰度值作为判据来计算得到比值。
1.2.5生化法检测T-SOD活性
取生长贴壁良好的细胞，按照实验方案及分组要求处理细胞，待细胞处理完成后，按照测定操作表说明书分别用试剂盒测T-SOD活力。
1.3统计学分析
采用S PSS 26.0统计软件对数据进行分析与处理，实验结果均以均数±标准差表示（M±SD），每组数据至少进行三次独立实验，以减少实验误差，组间比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），采用GraphPadPrism9.5.1分析与制图，以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01认为差异有统计学显著意义。
2结果
2.1 CCK-8结果
如图1所示，DOX+CeNPs组与DOX+Dex阳性药物保护组，相对于DOX损伤模型组，细胞活力显著增高，差异具有显著统计学意义（P<0.0001）。
2.2 Western blot检测结果
结果如图，DOX+CeNPs组与DOX损伤模型组对比，Bax蛋白表达水平下降（P<0.0001），Bcl-2蛋白表达水平增高（P<0.05），说明CeNPs可通过减少细胞凋亡达到对阿霉素损伤心肌细胞的保护，以上差异均具有统计学意义。
2.3生化法结果
结果如图4，与正常对照组相比，DOX损伤模型组SOD活力下降（P<0.01），CeNPs+DOX组、DOX+DEX组与DOX损伤模型组相比，SOD活力升高（P<0.05），以上差异均具有统计学意义。
3讨论
DOX抗肿瘤机制是通过与DNA相互作用，阻碍DNA复制和转录，导致肿瘤细胞凋亡。DOX可以通过与DNA结合，增加ROS水平，激活细胞凋亡途径，阻止细胞周期抑制诱导细胞凋亡。细胞中的ROS是维持细胞内信号转导的必要条件，但过量的ROS水平会造成伤害并导致细胞凋亡，许多癌症中，ROS能够介导细胞凋亡，这是细胞死亡的主要机制[5]。大量的实验数据表明，CeNPs对氧化应激引起的细胞凋亡有保护作用。事实上，CeNPs的细胞内抗氧化作用是其抗凋亡和促生存作用的直接基础，而所有这些突出的特点都取决于Ce3+/Ce4+氧化还原反应，CeNPs保留了细胞的抗氧化防御系统，并保护它们免受氧化剂引起的细胞凋亡[6]。
氧化应激的重要性是毋庸置疑的，它涉及许多难以治疗的病理状况。癌细胞中ROS的基础水平已经较高，而CeNPs由于其在酸性环境中的氧化特性，进一步增加ROS，CeNPs的独特之处在于它能够自我再生，减少增加的ROS水平而不影响正常细胞的基础水平，并且在癌细胞中具有选择性的促氧化剂活性，最终导致ROS诱导的癌细胞死亡。而大多数癌细胞的pH值较低；CeNPs有利于癌细胞产生过多的ROS，而不会在正常细胞中产生ROS，这一点似乎是可行的，细胞环境依赖CeNPs的活性。在细胞的中性pH环境中，CeNPs主要表现出过氧化氢酶和SOD模拟活性，从而减少了氧化压力。另一方面，在酸性pH值的情况下（肿瘤条件），CeNPs显示其氧化酶和过氧化物酶的活性，选择性地增加低pH值肿瘤细胞的氧化应激，最终导致肿瘤细胞的自由基诱导的细胞毒性[7-8]。
CeNPs颗粒由于其可转换的表面而具有独特性。三价铈原子（Ce3+）和四价铈原子（Ce4+）都可以在氧化铈的表面共存。CeNPs充当抗氧化剂的能力可能是由于氧化铈的再生抗氧化特性，由于自身的双重氧化状态，从Ce4+到Ce3+，创造了一个氧气空缺，表面的Ce3+作为超氧化物歧化酶的类似物发挥作用。它可以将超氧化物自由基转化为氧气和过氧化氢。还有报道，Ce3+可以将H2O2还原为H2O。上述反应产生的Ce4+还可以清除过氧化氢，生成氧气和水，最终消除ROS[9-10]。
综上所述，CeNPs通过调节凋亡相关蛋白表达，减轻DOX对H9C2大鼠心肌细胞的损伤；CeNPs通过提高SOD活性，增强抗氧化应激能力，缓解DOX对H9C2大鼠心肌细胞的损伤。
参考文献
[1]刘佳佳,李卫东,于英洁,等.阿霉素引起心脏毒性机制的研究进展[J].生命科学研究,2017,21(4):335-339.
[2]王广瑜,李东兵,孙琳琳,等.阿霉素的心脏毒性及其防治[J].中国癌症杂志,2014,24(1):44-48.
[3]王文燕,姚萍,王峰,等.纳米氧化铈的制备及其生物医学应用研究进展[J].中华生物医学工程杂志,2013,32(1):87-91.
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[5]吴亚平,杨婧.多柔比星对肿瘤细胞凋亡的作用机制研究进展[J].中国医药导报,2017,14(21):131-133.
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[7]王思佳.纳米氧化铈的生物学效应及其在肿瘤治疗中的应用[J].中国医学物理学杂志,2018,35(5):558-561.
[8]李晓静.纳米氧化铈的氧化应激疗法在肿瘤治疗中的应用前景[J].世界最新医学信息文摘,2017,17(60):95-96.
[9]陈建新,刘丹.CeO2纳米材料的制备及其在催化领域中的应用[J].化学通报,2015,78(5):372-376.
[10]黄文超,杨伟栋,邢敏.CeO2纳米材料的制备、表征及其应用研究进展[J].化工新型材料,2016,44(9):1-5.后台-系统设置-扩展变量-手机广告位-内容正文底部 -
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Ce NPs在DO X诱导的心脏毒性中的作用及对SOD的影响论文
人参与 2024-07-10 10:36:16 分类 : 医学 点这评论 作者：团论文网 来源：https://www.tuanlunwen.com/
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