团论文网
团论文网
-
摘要：脱细胞真皮基质口腔修复膜是临床上用于引导骨再生、促进伤口修复的生物膜产品。然而，目前常用的修复膜存在性能较差的问题，难以满足临床需求。为此，文章通过涂布法与真空热干燥法相结合的方式，在不破坏脱细胞真皮基质的前提下，将修复膜设计为双层结构，并探究不同浓度促骨因子对修复膜性能的影响。结果表明，研究所制备的修复膜具有双面不同结构，在钙磷比为1.6时，样品抗张强度为80.38 MPa，断裂拉伸率为118%，降解时间为42 d，孔隙率为82.74%，吸湿率为437%，且具备良好的生物相容性，与其他临床产品相比性能提升较大。
关键词：猪脱细胞真皮基质；口腔修复膜；槲皮素；钙磷比
口腔修复膜是由生物材料制成的生物膜，常用于牙周手术后局部组织的修补，可覆盖创面、避免感染、刺激局部组织生长，使伤口愈合后与新生组织融合[1]。传统临床再生修复治疗多采用钛膜等产品，能使插入的移植物稳定地保持在适当的位置上[2-3]，但缺点是种植后不易被吸收，通常需要通过手术进行切除，可能会造成二次伤害，削弱修复效果[4-5]。在此背景下，脱细胞真皮基质口腔修复膜凭借良好的可降解性与生物相容性，成为临床上的首要选择[6]。
就目前情况来看，常用的脱细胞真皮基质口腔修复膜性能较差，难以有效应对炎症过程中的肿胀情况，且结构单一。现代医疗要求脱细胞真皮基质口腔修复膜为两层或三层结构，并在内层添加促骨物质，外层添加抗菌物质，以实现协同促进骨再生作用。然而，现有双层结构的制备多采用静电纺丝法或将脱细胞真皮基质切成两层，在添加内外层对应物质后，使用黏合剂将两层黏合。但该种方法会破坏样品内部的空间结构，导致样品性能下降。因此，研究一种新型双层结构脱细胞真皮基质口腔修复膜具有重要的应用价值和现实意义。
本文将涂布法与真空热干燥法结合，以槲皮素为交联剂，内层使用β-磷酸三钙作为促骨物质，外层使用聚赖氨酸作为抗菌剂，在保留样品结构完整性的同时，制得了具有双层结构的猪脱细胞真皮基质的口腔修复膜，同时探究了不同钙磷比对口腔修复膜的机械强度、耐降解能力、孔隙率和生物相容性等性能的影响。
1材料与方法
1.1材料与试剂
猪皮来自市售6个月公猪腹部，由北京瑞健高科生物科技有限公司提供；氯化钠、十二烷基苯磺酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚、氢氧化钠、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胰酶、硫化钠、碳酸氢钠、甘氨酸、氯化铵、槲皮素、聚赖氨酸、氯化钙、磷酸氢二钠、PBS缓冲液、胶原蛋白酶，均来自国药集团化学试剂有限公司；丙三醇缩水甘油醚，来自上海争锐化工有限公司。
1.2仪器
恒温培养摇床（THZ-100上海一恒科学仪器有限公司）；离心机（TDL-80-2B上海安亭科学仪器厂）；超声机（XM-400ULF小美超声仪器）；真空冷冻干燥机（SCIENTZ-25T宁波新芝冻干设备股份有限公司）；烘箱（DFZ-6030A上海一恒科学仪器有限公司）；傅立叶红外光谱仪（Nicolet is10美国Thermo fisher）；差式热扫描仪（DSC-8000美国）；扫描电子显微镜（JSM-IT500HR日本）；微电脑式拉力试验机（TM2101-T5济南泰钦电气有限公司）；紫外分光光度计（UV-VIS UV5 METTLER TOLEDO）；酶标仪（Infinite 200 PRO美国TECAN）；倒置显微镜（OLYMPUS CKX53奥林巴斯（中国）有限公司）。
1.3方法
1.3.1口腔修复膜的制备
使用胶头滴管将CaCl2和Na2HPO4混合溶液滴加在样品表面，通过涂布法涂抹均匀，在28℃环境下真空热干燥5 min；在样品表面涂抹槲皮素溶液进行交联，重复12次。利用同样的方法将聚赖氨酸溶液滴加在样品的另一面。通过扫描电镜观察样品两面是否成功交联不同物质。
配制100 mL浓度为0.4 mol/L的Na2HPO4溶液，根据不同钙磷比（Ca/P=1.4、Ca/P=1.5、Ca/P=1.6、Ca/P=1.7）向其中添加CaCl2，搅拌，并使用NaOH溶液调整pH至7.0。将脱细胞真皮基质样品置于培养皿中，使用胶头滴管将搅拌均匀的CaCl2-Na2HPO4溶液滴加到样品表面，使用涂布法将溶液在样品表面涂抹均匀，在28℃环境下真空热干燥5 min；在样品表面涂抹槲皮素溶液进行交联，重复12次。利用同样方法将聚赖氨酸溶液交联在样品的粗糙面。
将制备好的样品用超纯水洗涤5次，送至冷冻干燥机中冻干24 h后，在35℃、湿度85%的干燥箱中回软6 h。
1.3.2口腔修复膜机械强度检测
将样品裁剪成长1.5 cm、宽1 cm的长方形。将试样放于拉力试验机上，上下两端夹紧固定，以100 mm/min的拉伸速度进行拉伸试验，记录拉断时的拉伸强度。断裂伸长率用游标卡尺测量，每组样品测试3次取平均值。
断裂伸长率（%）=断裂后总长度/断裂前总长度*100%（1）
1.3.3口腔修复膜耐降解能力检测
将干燥的脱细胞真皮基质切成方块并称重，在37℃条件下，以3 mL/mg的液料比值分别向每组加入浓度为5 U/mL的I/PBS型胶原酶溶液。每隔1 d更换1次酶液，在第1、3、5、7、14、20、28、36、42天取出干燥，对残留物称重，分析其耐降解能力。
1.3.4口腔修复膜孔隙率检测
称取样品1 g（准确到0.000 1 g），记为m1。将样品割为面积1 cm2左右的小碎片，置于50 mL容量瓶中，往瓶中加入去离子水定容至刻度标线。用循环水真空泵将容量瓶内抽真空至样品没有气泡冒出。对含有去离子水和样品的容量瓶称重，质量记为m2。再将样品碎片取出，对剩余的含有去离子水的容量瓶称重，质量记为m3[7]。每组进行3次平行实验，取平均值为最终结果。按照公式（2）计算样品的孔隙率。
P（%）=（m2-m3-m1）/(m2-m3)*100%(2)
1.3.5口腔修复膜吸湿保湿能力检测
将不同钙磷比的口腔修复膜干燥后称重，记为m1；将其在去离子水中浸泡24 h后取出，擦干表面水分称重，记为m2。吸湿率计算公式如（3）所示。
吸湿率(%）=(m2-m1)/m1×100%（3）
将样品放于37℃恒温干燥箱中，每隔一段时间取出称重，记为mt。保湿率按照公式（4）计算。
保湿率(%)=(mt-m1)/(m1-m0)×100%（4）
1.3.6口腔修复膜生物相容性检测
使用人口腔上皮细胞作为模型细胞，通过CCK-8测定体外评估口腔修复膜的细胞毒性。将样品浸泡于培养基中，调整细胞浓度调至1×104个/mL后，吸取100μL细胞悬液铺入96孔板中，同时设置完全培养基空白对照组，置于5%CO2、37。C恒温培养箱中孵育。在第1、3、5天，向96孔板中每孔加入10μL的CCK-8试剂，孵育2 h。使用酶标仪检测492 nm波长下样品的吸光度（OD600），每个样品设置6个重复试验。人口腔上皮细胞由上海市农业科学院保存。
1.3.7细胞增殖生长观察
使用倒置显微镜，在第1、3、5天对孔板放大10倍进行观察，分析培养基与最佳钙磷比口腔修复膜中上皮细胞的生长状况。
2结果与分析
通过扫描电镜观察口腔修复膜，确定其双层结构设计成功，并探究制备口腔修复膜的最佳钙磷比。
2.1口腔修复膜的制备
口腔修复膜可采用分层设计，以有效发挥其性能；内层负载促骨因子紧贴伤口，可更好地促进成骨细胞生成；外层为屏障层，负载抗菌物质，可防止外物对伤口造成损害，加速促进愈合部位的再生过程。具体如图1所示。
由图1可知，口腔修复膜内外层分别交联了不同物质，表明成功制备出了双层结构口腔修复膜。图1a显示，样品表面存在许多大小不一的颗粒物；图1b则表征颗粒较大的样品为白色晶状物聚集在一起，意味着钙离子与磷酸根离子在样品表面形成了磷酸三钙[8]。样品表面团小颗粒聚体数量较多，大颗粒聚体数量较少，说明样品并未过度沉积，不会对样品的孔隙率产生较大影响[9]。图1c为外层屏障层的扫描电镜图，反映了聚赖氨酸经涂抹后会覆盖在样品表面，形成涂层。放大后可知，聚赖氨酸并未完全覆盖，样品仍具有孔隙结构（见图1d）。
综上，该方法成功制备出了双层结构的口腔修复膜，且保留了胶原蛋白的纤维状结构，可更好地传递和分配外力，使口腔修复膜具备良好的力学传导性能，助力维持基质的结构稳定性[10-11]。
2.2钙磷比对口腔修复膜机械强度的影响
理想的口腔修复膜应具备良好的机械性能，以应对口腔修复过程中出现的发炎肿胀状况，以及咀嚼过程中的应力冲击。因此，本文使用槲皮素来交联内外两层材料。原因在于槲皮素的交联机理可形成化学键，最大程度地降低对材料的影响。
研究发现，随着钙磷比的提高，口腔修复膜的抗张强度逐渐增大，最高可达到82 MPa，而断裂拉伸率则与钙磷比成反比，即钙磷比越高，样品的断裂拉伸率越低，但仍高于116%。相较于目前市面上抗张强度普遍为20~40 MPa、断裂拉伸率为106%~112%的产品，实验所制口腔修复膜的性能实现了较大提升。抗张强度增大说明添加物与样品之间通过槲皮素形成了氢键[12]，使得胶原纤维间的排列更加紧密，从而提高了机械性能。断裂拉伸率下降可能是因为过高的钙磷比使样品表面生成了较多磷酸三钙晶体，提高了修复膜的结晶度，导致样品断裂拉伸率降低[13]。具体结果如图2所示。
2.3钙磷比对口腔修复膜耐降解能力的影响
口腔修复膜作为脱细胞真皮基质，通常具备可降解吸收的能力，会随着时间推移逐渐降解并促进新骨再生，无须通过二次手术去除。然而，如果恢复期间样品降解过快，会导致伤口暴露，易引发感染。因此，口腔修复膜还需要具备一定的耐降解能力。
研究发现，口腔修复膜在前7 d降解量较少，从7 d后样品降解速度逐渐提升，在第20天时仍具有较高质量，但28 d后样品质量开始急剧下降，降解速率加快。牙周组织再生通常需要4~6周的时间，而目前市面上的产品多在7 d后便开始急速降解。相比之下，本样品具有较强的耐降解能力，更符合恢复周期。聚赖氨酸可与脱细胞真皮基质发生静电相互作用，增强耐降解能力，而磷酸三钙则可通过物理阻隔与矿化来延缓降解进程[14]。随着钙磷比的增加，样品的耐降解能力也会逐渐增强。20 d后降解速率加快，可能是因为口腔修复膜在降解一段时间后出现的孔隙增多，使得内部改性较低的地方开始暴露，与降解酶接触的面积增大，加快了降解速度。而在钙磷比为1.7时样品的降解速度加快，则可能是因为钙磷比提高后，Ca2+浓度增加，促进了基质金属蛋白酶活性的增强[15]。具体如图3所示。
2.4钙磷比对口腔修复膜孔隙率的影响
口腔修复膜具有适宜的孔隙率，有利于成纤维细胞和成骨细胞等的迁移、增殖和分化，可更好地促进组织再生。如果孔隙率较低，则会阻碍无血管组织的形成和毛细血管的生长[16]。
研究发现，随着钙磷比的增加，样品的孔隙率提高，从81.5%提升到83.6%。通常来说，钙磷比的增加会使样品表面和内部团聚更多晶体，导致样品孔隙率降低。然而，试验中孔隙率呈上升趋势，说明磷酸三钙团聚后内部仍具有一定的孔隙，提高了样品的总孔隙率。虽然这并不会影响口腔修复过程中的营养交换能力，但是磷酸三钙的团聚会影响钙离子的释放速率，而如果钙离子释放速度过慢，则会减慢成骨速度，延长口腔恢复时间。综合分析，钙磷比为1.6时最为适宜，此时样品孔隙率为82.74%，符合口腔修复膜的孔隙率要求。具体如图4所示。
2.5钙磷比对口腔修复膜吸湿保湿能力的影响
对于口腔修复来说，其恢复过程需要保持适合的水合状态，以确保口腔黏膜、牙周组织保持正常生理功能，同时防止口腔干燥，减少不适感，促进组织修复。因此，口腔修复膜需要具备良好的吸湿保湿能力。不同钙磷比口腔修复膜的吸湿保湿能力如图5所示。
图5a为不同钙磷比对口腔修复膜吸湿能力的影响。可以观察到，钙磷比越高，吸湿能力越强，最高可接近480%。通常来说，磷酸三钙并不具备吸湿能力，其对液体的吸附为表面吸附，并不具有持久性。然而，随着钙磷比逐渐增加，样品的吸湿率会逐步提高。结合前述孔隙率分析结果，吸湿率增大的原因可能与孔隙率有关。SEM图说明，钙磷比增加后，口腔修复膜表面会团聚更多磷酸三钙晶体，而这种团聚具有一定的孔隙率，可使样品储存更多水分，增加样品的吸湿率。
样品的保湿能力如图5b所示。研究发现，口腔修复膜的保湿能力会随着钙磷比的增加而增强，且这可能与钙离子浓度有关。当钙离子浓度升高，表面钙位点数量会增加，使表面极性和亲水性增强，促进吸湿保水。并且，生成的磷酸三钙常用作保湿剂，具有良好的保湿能力。但随着时间延长，保湿能力会下降，这可能是因为口腔修复膜孔隙率增加，使水分蒸发速度加快。
2.6钙磷比对口腔修复膜生物相容性的影响
对于口腔修复来说，当植入材料（如口腔修复膜、骨填充材料等）接近伤口时，会不可避免地引发炎症反应。这是因为植入的材料会被识别为异物，促进炎症激活[17]，而炎症时间延长，会减缓破骨细胞活化并抑制成骨细胞活性，不利于口腔修复过程[18]。因此，口腔修复膜需要具备良好的生物相容性，以尽可能降低炎症反应的影响，促进细胞的增殖和分化。不同钙磷比口腔修复膜的生物相容性如图6所示。
研究发现，口腔修复膜样品的OD600均高于对照组，且随着天数增加，OD600值相差会越来越大。OD600通常与细胞数量成正比，即OD600越高，细胞数量越多，而细胞数量越多，则代表样品的细胞毒性越小，生物相容性越好。在第1天时，不同钙磷比的口腔修复膜与对照组相比，OD600均有提升，但提升量较小，而随着钙磷比的逐步提升，细胞数量会不断增加，说明磷酸三钙可促进细胞的增殖分化。相较于第1天，第3天时细胞数量增加较多，表明钙磷比越高，细胞数量越多。但当钙磷比为1.6及更高时，细胞数量增加量减少，细胞增长速率下降。这可能是因为过高的Ca2+浓度会使细胞出现凋亡，导致增加量减少。在第5天时，细胞数量仍呈增加趋势，表明口腔修复膜具有良好的生物相容性，可促进细胞增长。
2.7细胞增殖生长图
不同天数细胞生长观察结果如图7所示。
同一天培养基与口腔修复膜样品的对比可观察到，细胞均已开始增殖，但口腔修复膜样品的细胞明显多于培养基的细胞。在第1天时，可从图7b中观察到上皮细胞的形态，而培养基中则无法观察到。这说明，口腔修复膜具有促进细胞增殖的能力。对相同样品不同天数的观察对比可知，随着天数增加，能观察到的上皮细胞逐渐增多，说明细胞处于正常增殖状态。而且，从第3天开始，图中开始出现圆形的悬浮细胞，意味着细胞密度较高，即增殖的细胞较多。这进一步证实了口腔修复膜具有促进细胞增殖的能力。
3结论
本文将涂布法与真空干燥法结合，成功制备出具有双层结构的口腔修复膜。SEM结果表明，样品在保留脱细胞真皮基质胶原纤维结构的同时，在内外层分别附着了促骨因子与抗菌物质；性能分析结果表明，在Ca/P为1.6时，样品的抗张强度为80.38 MPa，断裂拉伸率为118%，降解时间为42 d，孔隙率为82.74%，吸湿率为437%，与目前市面上常用的产品相比，性能得到了显著提升。同时，样品对细胞增殖生长具有促进作用，可用于口腔修复方面的应用与研究。
参考文献
［1］ZAKRZEWSKI W,DOBRZYNSKI M,RYBAK Z,et al.Selected nanomaterials’application enhanced with the use of stem cells in acceleration of alveolar bone regeneration during augmentation process［J］.Nanomaterials,2020,10(6):1216.
［2］Kim Y K,Yun P Y,Kim S G,et al.In vitro scanning electron microscopic comparison of inner surface of exposed and unexposed nonresorbable membranes［J］.Oral Surgery,Oral Medicine,Oral Pathology,Oral Radiology,and Endodontology,2009,107(6):e5-e11.
［3］ROEHLING S,SCHLEGEL K A,WOELFLER H,et al.Zirconia compared to titanium dental implants in preclinical studies—a systematic review and meta analysis［J］.Clinical Oral Implants Research,2019,30(5):365-395.
［4］JURCZAK P,WITKOWSKA J,RODZIEWICZ-MOTOWID覵O S,et al.Proteins,peptides and peptidomimetics as active agents in implant surface functionalization［J］.Advances in Colloid and Interface Science,2020,276:102083.
［5］LI J,JANSEN J A,WALBOOMERS X F,et al.Mechanical aspects of dental implants and osseointegration:A narrative review［J］.Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials,2020,103:103574.
［6］陈一宁,但卫华,但年华.脱细胞真皮基质的改性及应用概述［J］.材料导报,2018,32(13):2311-9.
［7］夏维.N,N,N-三甲基壳聚糖/猪脱细胞真皮基质复合材料的制备与性能研究［D］,济南:山东大学,2018.
［8］YE X,ZHANG Y,LIU T,et al.Beta-tricalcium phosphate enhanced mechanical and biological properties of3D-printed polyhydroxyalkanoates scaffold for bone tissue engineering［J］.International Journal of Biological Macromolecules,2022,209:1553-1561.
［9］BARBALHO S M,ARAJO A C,DETREGIACHI C R P,et al.The potential role of medicinal plants in bone regeneration［J］.Alternative Therapies in Health and Medicine,2019,25(4):32-39.
［10］LIN Z,NICA C,SCULEAN A,et al.Enhanced wound healing potential of primary human oral fibroblasts and periodontal ligament cells cultured on four different porcine-derived collagen matrices［J］.Materials,2020,13(17):3819.
［11］TABATABAEI F S,MOHARAMZADEH K,TAYEBI L.Fibroblast encapsulation in gelatin methacryloyl(GelMA)versus collagen hydrogel as substrates for oral mucosa tissue engineering［J］.Journal of Oral Biology and Craniofacial Research,2020,10(4):573-577.
［12］CHEN Y,DAN N,WANG L,et al.Study on the cross-linking effect of a natural derived oxidized chitosan oligosaccharide on the porcine acellular dermal matrix［J］.RSC Advances,2016,6(44):38052-63.
［13］HE Y R,TIAN Y,ZHANG W J,et al.Fabrication of oxidized sodium alginate-collagen heterogeneous bilayer barrier membrane with osteogenesis-promoting ability［J］.International Journal of Biological Macromolecules,2022,202:55-67.
［14］CHI M,QI M,WANG P,et al.Novel bioactive and therapeutic dental polymeric materials to inhibit periodontal pathogens and biofilms［J］.International Journal of Molecular Sciences,2019,20(2):278.
［15］THARANATHAN R N,KITTUR F S.Chitin—the undisputed biomolecule of great potential［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2003,43(1):61-87.
［16］LEE J Y,PARK J Y,HONG I P,et al.3D-printed barrier membrane using mixture of polycaprolactone and beta-tricalcium phosphate for regeneration of rabbit calvarial defects［J］.Materials,2021,14(12):3280.
［17］CHANDORKAR Y,K R,BASU B.The foreign body response demystified［J］.ACS Biomaterials Science&Engineering,2018,5(1):19-44.
［18］TSUKASAKI M.RANKL and osteoimmunology in periodontitis［J］.Journal of Bone and Mineral Metabolism,2021,39(1):82-90.后台-系统设置-扩展变量-手机广告位-内容正文底部 -
本文标签：
猪脱细胞真皮基质口腔修复膜的制备与性能分析论文
人参与 2025-04-30 10:42:37 分类 : 理学 点这评论 作者：团论文网 来源：https://www.tuanlunwen.com/
-
站内搜索
-
随机文章
-
标签列表
-
-
最近发表
-
-
热门文章 | 最新文章 | 随机文章
-
-
最新留言
-
首页 论文知识 教育论文 毕业论文 教学论文 经济学 管理学 职称论文 法学 理学 医学 社会学 物理学 文献 工程论文 学位论文 研究论文
Powered 团论文网 版权所有 备案号：鄂ICP备2022005557号统计代码
全站搜索