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摘要：为获得能够抑制幽门螺杆菌的乳酸菌，文章从泡菜中筛选得到10株乳酸菌，并运用牛津杯法分别对这10株乳酸菌开展抑制幽门螺杆菌的试验。其中，有3株乳酸菌具有抑菌活性，分别为PW-2、PW-5和PW-7，且菌株PW-2的抑菌直径最大。通过观察菌株形态特征，并与16S rDNA基因序列进行比对分析，确定该菌株为植物乳杆菌。对该菌中的抑菌活性物质进行研究后发现，排除乳酸和H2O2后，其仍具有抑菌活性。同时，蛋白酶敏感试验表明，该菌株发酵液中的抑菌物质是蛋白质或多肽。此外，菌株PW-2中的抑菌物质在酸性条件下的抑菌活性较强，且具有一定的温度稳定性。
关键词：幽门螺杆菌；乳酸菌；抑菌活性
相关数据显示，我国幽门螺杆菌人群感染率接近50%。目前临床上治疗幽门螺杆菌感染最常见的方法是“三联”“四联”疗法，但其随着用药量的增多会导致细菌的耐药性增强[1]，且抗生素使用不当也会引起各种不良反应，如胃肠功能紊乱和胃肠道菌群失调等[2]。
近年来，乳酸菌已被用作消除幽门螺杆菌感染的重要辅助剂或主要治疗剂[3]。Hulst等[4]选取了一些感染幽门螺杆菌的患者，将其分为两组，对照组的患者接受常规的“三联”疗法，而实验组的患者接受乳酸菌与“三联”疗法相结合的治疗。经过8周呼吸试验后，实验组的幽门螺杆菌根除率达到94%，而对照组仅有76%。由此可见，使用乳酸菌治疗幽门螺杆菌具有重大的医学意义。
1材料与方法
1.1材料
自制泡菜水。
1.2主要试剂
MRS培养基、MRS肉汤，胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K，过氧化氢酶，乳酸。以上试剂均为分析纯。
1.3实验方法
1.3.1乳酸菌的分离
将泡菜水以3%的接种量于37℃条件下富集培养，将富集培养液在含有CaCO3的MRS培养基上进行梯度涂布，37℃环境下厌氧培养24 h，选取有溶钙圈的菌落进行纯化。
1.3.2抑制幽门螺杆菌的乳酸菌的筛选及鉴定
以幽门螺杆菌为指示菌、分离的乳酸菌为指标菌，使用牛津杯法筛选出对幽门螺杆菌具有抑制作用的乳酸菌。若观察到试验平板上有明显的抑菌圈，则说明该乳酸菌可以抑制幽门螺杆菌，反之则说明该乳酸菌没有抑制幽门螺杆菌的能力，重复试验2~3次。
对于具有抑菌活性的菌株，使用细菌DNA基因组提取试剂盒提取基因，并将其作为PCR模板进行16S rDNA扩增，同时将PCR产物测序进行同源性比对，并使用MEGA 7.0软件构建进化树分析。
1.3.3发酵液及指示菌的制备
（1）乳酸菌发酵上清液制备。将乳酸菌以3%的接种量接种培养24 h后，将发酵液进行离心处理并弃去沉淀，得到上清液，再用0.22μm的微孔滤膜过滤去除菌体，得到乳酸菌发酵液，并将其置于4℃冰箱中备用。
（2）指示菌的制备。按照幽门螺杆菌（ATCCⓇ43504TM）产品说明书进行培养，将活化好的幽门螺杆菌取50μL均匀涂布在含脱纤维羊血的ATCCⓇ260培养基上。
1.3.4乳酸菌菌株抑菌物质及其性质分析
（1）酶处理对发酵液中抑菌活性物质的影响。用1mol·L-1的HCl和NaOH将发酵液的pH分别调至过氧化氢酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K的最适值，即分别为7.0、2.0、6.0、7.4和7.4，再分别加入过氧化氢酶5 mg·mL-1、蛋白酶1 mg·mL-1，37℃水浴2 h后再将pH调回初始值，以未经酶处理的原始发酵液为空白对照，测定酶处理对发酵液中抑菌活性物质的影响。
（2）pH对发酵液中抑菌活性物质的影响。记录发酵液的原始pH，用HCl和NaOH溶液分别调节发酵液的pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，测定pH对发酵液中抑菌活性物质的影响。
（3）热处理对发酵液中抑菌活性物质的影响。将发酵液在60℃、80℃和105℃条件下分别水浴加热30 min，以及121℃条件下加热15 min后，测定热处理对发酵液中抑菌活性物质的影响。
2结果与分析
2.1乳酸菌的筛选
将不同浓度富集液在37℃环境下厌氧培养24 h后，挑选出溶钙圈较大的10株菌株进行纯化，编号为PW-1~PW-10。
2.2抑制幽门螺杆菌的乳酸菌的筛选
检测PW-1~PW-10抑制幽门螺杆菌的能力，筛选得到3株对幽门螺杆菌具有抑制效果的乳酸菌，分别为PW-2、PW-5、PW-7。其中，菌株PW-2对幽门螺杆菌的抑制作用最明显，抑菌圈直径达到17 mm。因此，选用此菌株开展后续实验。
2.3菌株16S rDNA的序列分析
测序后，将菌株PW-2的基因序列提交至Gen-Bank数据库进行同源性比对。研究发现，菌株PW-2与Lactobacillus fabifermentans的亲缘关系最近，同源性为98%。具体如图1所示。
2.4乳酸菌菌株的抑菌物质及其性质分析
2.4.1酶处理对发酵液抑菌活性的影响
菌株PW-2发酵液经不同酶处理后对幽门螺杆菌的抑制效果如表1所示。
结果显示，经过氧化氢酶处理后，PW-2上清液所产生的抑菌圈直径无明显变化，发酵上清液仍表现出较强的抑菌活性。可见，过氧化氢不是主要的抑菌活性物质。经蛋白酶处理后，样品的抑菌活性均发生了不同程度的改变，发酵上清液的抑菌活性与原发酵液相比存在显著差异，抑菌活性均降低，推测菌株PW-2发酵液中具有蛋白类抑菌物质，且对试验致病菌有抑菌活性作用。
2.4.2 pH对发酵液抑菌活性的影响
研究发现，当pH为2.0～6.0时，乳酸菌PW-2的发酵液能够抑制幽门螺杆菌。但是pH越高，发酵液抑制幽门螺杆菌的能力就越低，表明该乳酸菌PW-2发酵液中的蛋白类物质在酸性条件下更稳定。具体数据如表2所示。
2.4.3热处理对发酵液抑菌活性的影响
将乳酸菌PW-2分别在60℃、80℃、105℃的水浴条件下处理30 min，121℃热处理15 min后，测得的发酵液抑菌活性如表3所示。
由表3可知，随着温度的升高，菌株PW-2对指示菌幽门螺杆菌的抑菌圈直径逐渐变小，说明随着温度的升高，菌株PW-2抑制幽门螺杆菌的能力逐渐衰弱。经60℃和80℃处理30 min后，发酵液的抑菌能力还比较强，几乎未受影响；而经105℃处理30 min后，发酵液的抑菌能力有所降低，但其抑菌活性仍能够保持70%，证明该乳酸菌PW-2发酵液中的蛋白类物质对热不敏感。
3结论
本文从自制泡菜中筛选出了3株对幽门螺杆菌具有抑制效果的乳酸菌。其中，菌株PW-2的抑菌作用最明显，其抑菌圈直径达到了17 mm。通过观察菌株形态特征，并与16S rDNA基因序列进行比对分析确定，该菌株为植物乳杆菌（L.fabifermentans）。通过实验挖掘菌株PW-2中的抑菌物质发现，其对碱性环境和蛋白酶较为敏感，结合本试验所得出的热稳定性，符合蛋白质所具有的性质，进一步为证明该菌种发酵液中存在蛋白类抑菌物质提供了依据。目前有很多关于细菌的蛋白类胞外抑菌分泌物的分离纯化的报道[5]，因此这类蛋白抑菌物质又被称为细菌素。
参考文献
［1］刘秋芳,陈作波,洪可仲.益生菌联合四联疗法治疗难治性幽门螺杆菌感染的临床效果［J］.中国当代医药,2019,26(18):87-89.
［2］韦军.幽门螺杆菌对6种抗生素的耐药性研究［J］.中国社区医师,2020,36(8):125,127.
［3］龚芳红,贺松,张德纯,等.国内益生菌制剂清除幽门螺杆菌感染临床疗效的Meta分析［J］.中国微生态学杂志,2009,21(9):817-821.
［4］HULST R,HOFF B.Treatment of Helicobacter pylori eradication failure［J］.Clinical Pharmcology&Therapy of Helicobacter Pylori Infection,2004,11(15):317-328.
［5］KUMARI A G,RASHMI K,K S S,et al.Bacteriocin production and different strategies for their recovery and purification［J］.Probiotics and antimicrobial proteins,2014,6(1):47-58.后台-系统设置-扩展变量-手机广告位-内容正文底部 -
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抑制幽门螺杆菌乳酸菌的筛选及抑菌物质的特性研究论文
人参与 2024-09-26 10:47:39 分类 : 理学 点这评论 作者：团论文网 来源：https://www.tuanlunwen.com/
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