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奥希替尼联合阿帕替尼延缓T790M突变非小细胞肺癌奥希替尼耐药的研究论文

 人参与  2024-07-10 11:20:08  分类 : 医学  点这评论  作者：团论文网  来源：https://www.tuanlunwen.com/
　　摘要：目的分析奥希替尼联合阿帕替尼延缓T790M突变非小细胞肺癌（NSCLC）奥希替尼耐药的临床效果。方法构建19外显子缺失/T790M突变NSCLC小鼠移植瘤模型，将造模成功的80只小鼠采用随机数字表法分为空白对照组、阿帕替尼单药组、奥希替尼单药组、联合组，每组20只。比较四组小鼠肿瘤生长情况以及EGFR、VEGF/VEGFR等信号传导通路相关蛋白表达情况。结果给药前，四组肿瘤体积比较差异无统计学意义（P>0.05）；给药30d，与给药前相比，阿帕替尼单药组、奥希替尼单药组及联合组肿瘤体积均缩小，同时小于空白对照组，而空白对照组肿瘤体积则增大（P<0.05）。与空白对照组相比，阿帕替尼单药组、奥希替尼单药组及联合组Ki-67、EGFR、VEGFR蛋白以及mTOR、AKT、ERK蛋白表达水平均显著下降（P<0.05）。结论奥希替尼联合阿帕替尼可明显抑制T790M突变NSCLC小鼠肿瘤生长，提高奥希替尼治疗敏感性，延缓耐药，其机制可能与抑制EGFR及VEGF/VEGFR信号传导通路有关。

　　关键词：非小细胞肺癌；T790M突变；奥希替尼；阿帕替尼；耐药

　　0引言

　　奥希替尼是第3代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-Tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI），已被研究证实在第1/第2代EGFR-TKI耐药并对产生获得性EGFR基因T790M突变的非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者治疗效果显著[1]。但研究表明，虽然约有2/3的T790M突变NSCLC患者对奥希替尼治疗具有反应性，但大部分患者在治疗10个月左右仍产生耐药情况[2]。而阿帕替尼是一种小分子血管内皮细胞生长因子受体2（Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2）TKI，可抑制肿瘤血管生成[3]。多项研究已证实阿帕替尼与第1代EGFR-TKI产生协同作用，逆转T790M突变NSCLC对第一代EGFR-TKI的耐药性[4]。基于此，本研究拟通过细胞及动物实验来验证奥希替尼联合阿帕替尼延缓T790M突变非小细胞肺癌（NSCLC）奥希替尼耐药的临床效果，为T790M突变NSCLC以奥希替尼为基础的联合治疗在临床应用推广提供新的理论依据和新的干预策略。

　　1资料与方法

       1.1动物

　　SPF级BALB/C小鼠80只，雄雌各半，4~6周龄，20g左右，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。研究前在SPF级动物实验室适应环境1周，温度22±2℃,湿度60%~70%，研究所需饲料、水、垫料均经高压消毒灭菌处理。

　　1.2药品、主要试剂及仪器

　　奥希替尼购自Selleck公司；阿帕替尼购自江苏恒瑞股份有限公司；mTOR抗体、AKT抗体均购自Cell Signaling Technology公司；EGFR、VEGFR、ERK抗体均购自Santa cruz公司；免疫组织化学SP超敏试剂盒及DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3方法

　　1.3.1 T790M突变NSCLC造模及分组

　　将大约2×106个PC-9ER肺癌细胞（19外显子缺失/T790M突变）悬浮液与基质胶1:1混合的0.2mL PBS溶液中，将其皮下注射到裸鼠的右胁腹区，肿瘤接种后10d左右（肿瘤生长至500mm3）时分组。

　　1.3.2 T790M突变NSCLC小鼠给药剂量

　　共有80只小鼠造模成功，采用随机数字表法分为空白对照组、阿帕替尼单药组、奥希替尼单药组、联合组，每组各20只。空白对照组给予生理盐水口服灌胃，阿帕替尼单药组给予阿帕替尼50mg/kg口服灌胃、奥希替尼单药组给予5mg/kg口服灌胃、联合组给予阿帕替尼50mg/kg+奥希替尼5mg/kg口服灌胃。上述药物均1次/d，连续30d。每间隔3d记录测量四组小鼠的肿瘤大小，30d后处死全部小鼠。

　　1.4观察指标

　　①每间隔3d记录测量四组小鼠的肿瘤大小，比较治疗四组小鼠肿瘤生长抑制情况。②治疗30d后，取小鼠肿瘤组织石蜡包埋后进行连续切片用于免疫组化分析四组小鼠肿瘤组织中肿瘤细胞增殖指数（Ki-67）、EGFR、VEGFR2蛋白表达情况。③治疗30d后，取小鼠肿瘤组织裂解后，检测蛋白质含量用于Western blotting分析四组小鼠肿瘤组织雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）、蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）表达水平。

　　1.5统计学方法

　　采用SPSS 25.0软件进行数据处理，计量资料均经Shapiro-Wilk正态性检验，符合正态分布的计量资料采用x—±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，计数资料用百分比表示，采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2结果

　　2.1四组肿瘤生长情况比较

　　给药前，四组肿瘤体积比较差异无统计学意义（P>0.05）；给药30d，与给药前相比，阿帕替尼单药组、奥希替尼单药组及联合组肿瘤体积均缩小，同时小于空白对照组，而空白对照组肿瘤体积则增大（P<0.05）。见表1。
 

 
　　2.2四组Ki-67、EGFR、VEGFR2蛋白表达比较

　　与空白对照组相比，阿帕替尼单药组、奥希替尼单药组及联合组Ki-67、EGFR、VEGFR蛋白表达水平均显著下降（P<0.05）。见表2。
 

 
　　2.3四组mTOR、AKT、ERK蛋白表达比较

　　与空白对照组相比，阿帕替尼单药组、奥希替尼单药组及联合组mTOR、AKT、ERK蛋白表达均显著下降（P<0.05）。见表3。
 

 
　　3讨论

　　奥希替尼具有双重抑制突变的能力，其可在EGFR的TK结构域内的第797位点不可逆的共价键合半胱氨酸残基，进而发挥抑制肿瘤生长的能力，但单一应用时肿瘤细胞因EGFR信号通路、旁路信号通路的激活、细胞表型转化等原因易产生奥希替尼耐药，降低其对奥希替尼的治疗敏感性[5]。刘洋[6]等研究指出在奥希替尼用药基础上联合抗血管生成药物，即贝划珠单抗可提高奥希替尼单药治疗效果，提示通过联合抑制VEGF信号来抑制EGFR信号通路，可能会增加EGFR突变肺癌患者获益程度。而阿帕替尼是一种小分子VEGFR2 TKI抑制剂，其可拮抗肿瘤血栓形成，并抑制肿瘤细胞活性，其与奥希替尼联合应用提高对肿瘤生长的抑制效果的机制可能与通过抑制EGFR及VEGF/VEGFR信号通路有关，但具体机制仍需研究进一步证实。另有研究证实，EGFR及VEGF信号通路存在“crosstalk”效应，两者具有协同促进肿瘤生长的作用[7]。本研究观察到四组中联合组抑制肿瘤生长的效果更显著，且联合组Ki-67、EGFR、VEGFR蛋白表达下调幅度最大。

　　mTOR、AKT及ERK蛋白是EGFR及VEGF/VEGFR下游信号通路的重要蛋白之一，其磷酸化是调控肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭及化疗耐药的关键。其中mTOR是细胞生长及增殖的重要调节因子，也是AKT下游信号通路的主要靶点，其可通过磷酸化核糖体蛋白S6激酶和翻译真核起始因子4E结合蛋白1等来刺激蛋白质合成，进而参与细胞生长、增殖、代谢、血管生成等多种生理及病理的调节过程；AKT磷酸化后可激活一氧化氮合酶，促进肿瘤局部微血管形成；ERK是将信号从表面受体传导至细胞核的关键，在细胞增殖分化、凋亡、癌变等过程中具有重要作用[8]。本研究通过观察四组mTOR、AKT、ERK蛋白表达情况发现，联合组上述蛋白表达下调幅度最大，提示奥希替尼联合阿帕替尼降低或延缓奥希替尼的耐药机制可能与抑制EGFR及VEGF/VEGFR下游信号通路有关。

　　综上所述，奥希替尼联合阿帕替尼可明显抑制T790M突变NSCLC小鼠肿瘤生长，提高奥希替尼治疗敏感性，延缓耐药，其机制可能与抑制EGFR及VEGF/VEGFR信号传导通路有关。

　　参考文献

　　[1]冯霞,肖建,敬梅,等.奥希替尼联合贝伐珠单抗一线治疗EGFR敏感突变阳性晚期非小细胞肺癌的临床疗效观察[J].临床和实验医学杂志,2022,21(16):1697-1700.

　　[2]黄章洲,庄武,尹一,等.晚期肺腺癌患者奥希替尼后线治疗耐药后基因突变模式研究[J].中华实用诊断与治疗杂志,2022,36(1):9-13.

　　[3]韩翠云,张士秀,洪秀.阿帕替尼联合吉非替尼方案治疗驱动基因阳性晚期非小细胞肺癌患者的效果[J].中国医药导报,2022,19(17):119-122.

　　[4]张明晖,孙雅丽,杨艳,等.甲磺酸阿帕替尼联合埃克替尼治疗埃克替尼耐药的非小细胞肺癌的效果分析[J].癌症进展,2019,17(7):798-800,807.

　　[5]顾艳斐,田笑如,王若天,等.奥希替尼联合贝伐珠单抗在获得性EGFR T790M突变晚期非小细胞肺癌的疗效分析[J].中国肺癌杂志,2022,25(12):843-851.

　　[6]刘洋,熊志成,孙鑫,等.奥希替尼联合抗血管生成靶向药对人肺腺癌细胞抑制作用的实验研究[J].现代肿瘤医学,2018,26(19):3003-3008.

　　[7]Lichtenberger B M,Tan PK,NiederIeithner H,et a1.Autocrine VEGF signaling syne rgizes with EGFR in tumor cells to promote epithelial cancer development[J].Cell,2010,140(2):268-279.

　　[8]马小花,陈瑞英,欧阳松云,等.NHE1通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调节肺癌免疫抑制及对癌细胞的作用[J].实用癌症杂志,2023,38(1):1-6,10.
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