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[摘要]目的验证阳离子脂质体介导神经营养因子3（Neurotrophin-3,NT3）基因转染对噪声致豚鼠耳聋的保护作用。方法选取广西医科大学动物实验中心提供的60只健康花色黑目豚鼠为研究对象，按随机数字表法分为5组，每组12只（实验过程中部分动物死亡，实际实验数据按每组10只统计）。Ⅰ组未受噪声影响，Ⅱ组注入人工外淋巴液未受噪声刺激，Ⅲ组注入人工外淋巴液后受噪声刺激，Ⅳ组在注入空质粒后受噪声刺激，V组在注入含NT3基因的质粒后受噪声刺激。噪声为4 kHz的稳态白噪声，强度100 dB，8 h/d，连续10 d，休息5 d，再通过听性脑干反应（Auditory Brain-Stem Response,ABR）测试和免疫组织化学染色来评估听阈变化和耳蜗螺旋神经节细胞中NT3蛋白的表达情况。结果V组ABR阈值高于Ⅰ、Ⅱ组，但低于Ⅲ、Ⅳ组，差异有统计学意义（P均<0.05）。耳蜗螺旋神经节细胞处NT3蛋白表达量以V组较其余各组更高，差异有统计学意义（P均<0.05）。结论NT3基因转染后阈值增幅减小，听功能受损有一定程度减轻，对噪声致豚鼠耳聋具有一定程度的保护作用。
[关键词]神经营养因子3；基因转染；阳离子脂质体；耳蜗；噪声
神经营养因子3（Neurotrophin-3,NT3）对维持神经系统的正常功能承担着重要作用，也是内耳发育的最基本的营养因子，在体内外实验中均被证实是维持听觉上皮和听觉神经元生存的重要物质[1-2]。本研究选取广西医科大学动物实验中心提供的60只健康花色黑目豚鼠为研究对象，旨在探究NT3基因转染对噪声诱导的豚鼠耳聋的保护作用。为此，利用了前期实验中成功构建的携带增强绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）报告基因的重组质粒pEGFP-NT3。该质粒与阳离子脂质体复合物通过圆窗注入豚鼠的耳蜗中，以实现NT3基因的有效转染。术后，实验豚鼠接受噪声刺激，模拟噪声性耳聋的发病过程。同时为了评估NT3基因转染的保护效果，采用了客观的听性脑干反应（Auditory Brain-Stem Response,ABR）测试[3]来检测实验豚鼠的听阈变化，反映耳蜗和听觉神经通路的功能状态。此外，还通过免疫组织化学染色技术观察了螺旋神经节细胞的形态变化以及NT3蛋白的表达情况，以进一步验证NT3基因转染对噪声性耳聋的保护作用，不仅有助于揭示NT3在听觉系统保护中的作用机制，还可能为开发新的耳聋治疗手段提供重要的实验依据。现报道如下。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物
选用体质量300~350 g，3~4月龄，耳廓反射灵敏，健康花色黑目豚鼠（广西医科大学动物实验中心提供），雌雄不限，实验前行ABR测试排除听阈>40 dB者，选取60只，饲养1周以适应本实验室的饲养条件。
1.1.2主要实验仪器
电生理测试仪、插入式耳机、针状电极，手术解剖显微镜，病理图像显微镜，超低温冰箱、切片机等（广西医科大学实验中心提供）。
1.1.3主要实验试剂
pEGFP-C1、pEGFP-NT3为广西医科大学实验室保存；质粒小量抽提试剂盒、阳离子脂质体LipofectamineTM2000、一抗羊抗鼠NT3多克隆抗体、二抗兔抗羊、戊巴比妥钠、听力计，0.1 mol/L及0.2 mol/L磷酸缓冲液、4%多聚甲醛固定液、1%盐酸酒精等化学试剂均为分析纯。
1.2实验方法
1.2.1动物分组
将60只健康豚鼠随机分为5组，每组12只（实验过程中部分动物死亡，实际实验数据按每组10只统计）。Ⅰ组：不给噪声；Ⅱ组：经左耳注入人工外淋巴液后不给噪声；Ⅲ组：经左耳注入人工外淋巴液后给噪声；Ⅳ组：经左耳注入空质粒pEGFP-C1后给噪声；V组：经左耳注入pEGFP-NT3后给噪声，其中噪声为由听力计发出中心频率为4 kHz的稳态白噪声，经扩大后输出到隔音箱内的扬声器，强度100 dB，8 h/d，连续10 d，休息5 d后检测。
1.2.2 ABR测试
各组实验动物分别于给噪声前后两次进行ABR测试。豚鼠经1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射全麻后，置于屏蔽仓内进行测试。记录仪器使用电生理测试仪，插入式耳机豚鼠外耳道气导给声，短声刺激，最大刺激输出为135 dB。刺激频率21.1次/s，带通滤波100~3 000 Hz，扫描时间10 ms，叠加次数512次。记录电极置于额顶正中，参照电极置于同侧耳垂，接地电极置于鼻尖。测试声从135 dB开始，以10或5 dB逐项递减，以能引出明确的、可重复观察波形的最小刺激强度为听阈。排除术前听阈>40 dB者。
1.2.3阳离子脂质体与质粒复合物的制备
将阳离子脂质体（LP2000）20µl加入60µl人工外淋巴液（1 mmol/L）中，轻轻混匀，静置5 min后加入10µl质粒pEGFP-NT3（1µg/µl），充分混匀，室温静置20 min后备用。同法制备阳离子脂质体-空质粒复合物。其中人工外淋巴液的成分：NaCl137 mmol/L，KCl 5 mmol/L，CaCl2 2 mmol/L，NaH2PO4 1 mmol/L，Glucose 11 mmol/L，NaHCO3 12 mmol/L，MgCl2 1 mmol/L；pH 7.4±0.2，渗透压（300±2）mOsm/L；过滤除菌备用。
1.2.4耳蜗内微量注射术
1%戊巴比妥钠（国药准字H31021724；规格：0.25 g）40 mg/kg腹腔注射麻醉动物，常规消毒铺巾。左耳后下切口，于听泡背侧探针找到听泡骨质薄弱点（一般距外耳门内下5 mm处），用咬骨钳于听泡骨质薄弱点处凿开直径约1 cm小孔，手术解剖显微镜下暴露耳蜗底回，用细针在耳蜗底回近圆窗处钻一直径1 mm小孔，用微量注射器将10µl阳离子脂质体-质粒复合物缓慢注入耳蜗鼓阶内，明胶海绵覆盖注射孔，缝合耳后切口。
1.2.5免疫组织化学染色
1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉动物，行ABR测试后，耳蜗标本予10%EDTA脱钙30 d，组织石蜡包埋备用，采用SP法，参照试剂盒使用说明书行免疫组织化学染色。用病理图像显微镜照相并分析，以细胞阳性染色（胞浆和胞核呈棕黄色）的灰度值比较抗原表达量。
1.3统计方法
使用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计数资料（ABR阈值、NT3蛋白表达量）符合正态分布，以(±s）表示，组间比较采用析因方差分析和组间SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 5组豚鼠给噪声前后ABR阈值比较
各组动物给噪声前左右耳ABR阈值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。给噪声后，Ⅰ组和Ⅱ组阈值均<40 dB，Ⅲ组和Ⅳ组阈值均>100 dB，V组阈值范围为70~90 dB，V组ABR阈值高于Ⅰ、Ⅱ组，但低于Ⅲ、Ⅳ组，差异有统计学意义（P均<0.05），见表1。
2.2 5组豚鼠免疫组织化学染色检测螺旋神经节细胞的NT3蛋白表达量比较
每组各取10只动物的左耳（术耳）耳蜗标本行SP法免疫组织化学染色，V组灰度值103.54±21.36较其余各组更低，蛋白质表达量更高。差异有统计学意义（P均<0.05）。见表2。
3讨论
本研究通过ABR测试和免疫组织化学染色，观察到NT3基因转染组在噪声暴露后的听阈显著低于对照组，且耳蜗螺旋神经节细胞中NT3蛋白的表达量显著增加表明，表明NT3基因转染可能通过促进耳蜗螺旋神经节细胞的存活和功能，从而减轻噪声引起的听力损伤。
噪声性耳聋发病机制涉及多种因素，包括代谢紊乱、氧化应激、细胞凋亡等，目前多数研究认为其直接原因是噪声暴露导致耳蜗毛细胞损伤，进而影响螺旋神经节细胞的功能，最终导致听力下降[4]，而在遗传学方面则认为是相关基因对的缺失或是表达障碍而导致神经元的衰老和凋亡进程加速导致[5]。本研究中，噪声暴露后ABR阈值的显著升高也与既往的临床研究和动物研究结果一致[6-7]，再次确认了噪声暴露是噪声性耳聋的主要诱因。NT3作为神经营养因子家族的一员，已被证实对听觉神经元具有保护作用，如通过促进神经元存活和轴突再生来保护听觉系统[8-9]，本研究发现NT3基因转染后，豚鼠的听阈增幅减小，表明NT3可能通过促进耳蜗螺旋神经节细胞的存活，减轻噪声引起的听力损伤。此外，免疫组织化学染色结果显示，NT3基因转染组的耳蜗螺旋神经节细胞中NT3蛋白表达量显著增加，进一步支持了NT3在噪声性耳聋中的保护作用，也为NT3在噪声性耳聋治疗中的潜在应用提供了新的视角。NT3可能通过多种机制发挥其保护作用，如NT3能够促进耳蜗螺旋神经节细胞的存活，减少噪声引起的细胞凋亡[10-11]。还有研究指出NT3在生物活性物质如银杏二萜内酯的影响下，其表达可能通过调节如SIRT1/STAT3等细胞内信号通路，增强细胞的抗氧化能力，从而减轻氧化应激损伤[12]，进而减少听力损失。因此，基于本研究结果以及既往研究的观点，NT3的保护作用可能对其他类型的感音神经性耳聋也具有潜在的治疗价值。
尽管本研究提供了NT3基因转染在噪声性耳聋治疗中的潜在应用，但仍有许多问题需要进一步研究。例如，NT3基因转染的最佳剂量和时间窗口、长期效果和安全性评估等。此外，探索NT3与其他神经营养因子的协同作用，以及开发更有效的基因转染策略，也是未来研究的重要方向。
综上所述，NT3基因转染能够减轻噪声性耳聋豚鼠模型的听力损伤。
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NT3基因转染对噪声性耳聋的影响研究论文
人参与 2024-11-15 10:19:17 分类 : 医学 点这评论 作者：团论文网 来源：https://www.tuanlunwen.com/
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