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NF-κB p65通过miR-150/TRPC6信号通路改善肾缺血再灌注损伤论文

 人参与  2025-01-10 09:43:30  分类 : 医学  点这评论  作者：团论文网  来源：https://www.tuanlunwen.com/
　　[摘要]目的探究NF-κB（nuclear transcription factor-κB,NF-κB）p65通过miR-150/瞬时受体电位阳离子通道6（transient receptor potential cation channel 6,TRPC6）信号通路促进肾缺血再灌注损伤的作用。方法选取2022年8月—2023年8月由齐齐哈尔医学院医药科学研究院购买的60只雄性大鼠作为研究对象，将体质量相似的大鼠按照随机数字表法随机分为3组：假手术实验组（Sham组，n=10）、缺血/再灌注（ischemic/reperfu⁃sion,I/R）I/R实验组（n=10）、慢病毒实验组（n=40），其中慢病毒实验组分为miR-150-mimic组（n=10）、I/R+miR-150-mimic组（n=10）、NF-κB p65-si组（n=10）、I/R+NF-κB p65-si组（n=10）。评估各组大鼠肾组织中血清肌酐（creatinine,Cr）和血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、炎性因子、miR-150、NF-κB p65、TRPC6的水平。结果I/R实验组与Sham组比较，NF-κB p65、miR-150蛋白水平降低（0.26±0.02 vs 0.79±0.03、0.34±0.08 vs 1.46±0.12），TRPC6蛋白水平下降（0.35±0.04 vs.1.08±0.15），差异有统计学意义（t=46.484、24.558、8.603，P均<0.05）。与I/R实验组相比，I/R+miR-150-mimic组TRPC6水平升高，而炎症因子水平更低，I/R+NF-κB p65-si组miR-150水平更高，炎症因子水平升高，差异有统计学意义（P均<0.05）。结论NF-κB p65通过调节miR-150/TRPC6信号通路影响肾功能及炎症，改善肾缺血再灌注损伤。

　　[关键词]NF-κB p65；miR-150；瞬时受体电位阳离子通道6；肾缺血再灌注损伤

　　肾缺血再灌注损伤（renal ischemia-reperfusion injury,RIRI）是临床上急性肾损伤（acute-kidney-injury,AKI）的重要致病原因之一[1]。肾缺血再灌注损伤是指肾组织在缺血后恢复血流供应，组织损伤程度持续加重。瞬时受体电位阳离子通道6（tran⁃sient receptor potential cation channel 6，TRPC6）为肾小球滤过屏障的重要组成部分[2]，对维持肾小球滤过膜的完整性具有重要的作用，进而参与多种肾小球疾病的调控[3]。微小RNA（microRNAs,miRNAs）miR-150是非编码小分子RNA，在细胞增殖和凋亡等生物学过程中扮演重要角色[4-5]。核转录因子NF-κB（nuclear transcription factor-κB,NF-κB）p65作为重要的转录因子，由一个复杂的体系组成，参与多种生理、病理过程的基因调控[6]。miR-150可能在肾缺血再灌注损伤中起重要作用，但其是否通过调节TRPG6促进肾缺血再灌注损伤发生发展尚不明确。基于此，本研究旨在探讨转录因子NF-κB p65调节肾缺血再灌注损伤的具体机制。现报道如下。

　　1材料与方法

　　1.1材料与分组

　　选取2022年8月—2023年8月由齐齐哈尔医学院医药科学研究院购买的60只雄性大鼠作为研究对象，将体质量相似的大鼠按照随机数字表法随机分为3组：假手术实验组（Sham组，n=10）、缺血/再灌注（ischemic/reperfusion,I/R）I/R实验组（n=10）、慢病毒实验组（n=40），其中慢病毒实验组分为miR-150-mimic组（n=10）、I/R+miR-150-mimic组（n=10）、NF-κB p65-si组（n=10）、I/R+NF-κB p65-si组（n=10）。本研究通过齐齐哈尔医学院实验动物伦理委员会审批[（齐医）动审[2022]69号]。

　　1.2动物模型的建立

　　实验建立肾脏损伤I/R的大鼠模型：将大鼠禁食过夜，腹膜内注射1%的戊巴比妥钠（国药准字H31020240；规格：50 mg）（50 mg/kg）进行麻醉。然后将大鼠放在加热垫上以保持恒定的体温。随后，于腹膜后脊柱两侧确定两个肾蒂，辨认出左右肾动脉后利用血管夹对大鼠左肾蒂进行45 min的闭塞，松开后完全恢复血供，进行血流再灌注。假手术组的大鼠接受相同的手术操作，但不进行任何血管阻塞操作。实验组在缺血后进行慢病毒注射，在大鼠尾静脉分别注射慢病毒载体颗粒滴度为1×109 TU/mL的携带NF-kB p65-si、miR-150-mimic的慢病毒载体，缺血45 min后，松开血管夹恢复血流灌注24 h后处死大鼠，取肾脏组织和血液留待检测。

　　1.3观察指标

　　肾功能指标检测。再灌注24 h后处死大鼠，从大鼠眼眶静脉获得血液样本。将血液离心（4 500 rpm）以分离血清。通过测量肌酐（creatinine,Cr）和血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）水平反映肾功能的损伤情况。

　　肾组织炎性因子水平测定。将大鼠肾脏组织在磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中匀浆，并在4°C下以14 000 g离心15 min，收集上清液并保存在-20°C进行进一步分析。使用酶联免疫吸附试剂盒检测细胞因子白细胞介素10（interleukin 10,IL-10）、白细胞介素1β（interleukin 1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子a（tumor necrosis factor a,TNF-a）的水平。

　　miR-150、NF-κB p65、TRPC6的表达水平。通过蛋白印迹技术（western blot,WB）和实时荧光定量（quantitative polymerase chain reaction,q-PCR）检测miR-150、NF-κB p65、TRPC6的表达水平。

　　1.4统计方法

　　数据分析采用SPSS 21.0统计学软件进行。经Shapiro-Wilk检验符合正态分布的计量资料（NF-κB p65、miR-150、TRPC6蛋白表达水平、肾功能指标及炎症因子水平）用(±s）表示，组间比较行两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1 I/R实验组与Sham组NF-κB p65、miR-150、TRPC6蛋白表达水平比较

　　I/R实验组与Sham组比较，NF-κB p65、miR-150蛋白水平降低，TRPC6蛋白水平下降，差异有统计学意义（P均<0.05）。见表1。
 

 
　　2.2各组miR-150、TRPC6、肾功能指标及炎症因子水平比较

　　miR-150-mimic组的Cr、BUN、IL-1β、IL-10及TNF-a水平相较于Sham组和I/R实验组更低；与I/R实验组相比，I/R+miR-150-mimic组TRPC6更高，肾功能指标及炎症因子水平更低，I/R+NF-κB p65-si组TRPC6、miR-150水平更高，肾功能指标及炎症因子水平更低，差异有统计学意义（P均<0.05）。见表2。
 

 
　　3讨论

　　肾缺血再灌注损伤是一种严重的综合征，其特征是肾功能受损，并与加速慢性肾脏疾病的高发病率有关，慢性肾脏病可能发展为终末期肾脏疾病，并因多器官衰竭而增加病死率[7]。肾缺血再灌注过程是一系列细胞事件，可分为两个步骤，即缺血和再灌注。在再灌注阶段，由于暂时中断的血流恢复，活性氧产生不平衡，抗氧化酶系统下调，最终导致组织损伤的二次恶化[8]。随着缺血持续时间的增加，肾脏将有更多的肾小管上皮细胞损失进入管腔，肾功能严重受损，坏死和细胞凋亡增加。本研究结果显示，NF-κB p65通过抑制炎症来保护缺血再灌注肾脏I/R损伤，NF-κB p65预处理下调I/R损伤的大鼠模型中炎症因子IL-1β、IL-10和TNF-a水平（P均<0.05）。何荃等[8]研究糖尿病肾病大鼠肾损伤，结果显示冬凌草甲素通过抑制NF-κB p65的活化而降低促炎因子IL-6和TNF-α表达，并增强抗炎因子IL-4和IL-10表达（P均<0.05），进而缓解糖尿病肾病大鼠肾损伤和免疫紊乱。这一研究与本研究结果一致，均证明NF-κB p65可通过抑制炎症进而改善肾病模型幼鼠的肾损伤。另外NF-κB p65预处理上调miR-150表达，下调TRPC6水平。从机制上讲，miRNAs是一类短单链（含21~25个核苷酸）的非编码RNA，其可在转录后水平上负向调节靶基因的表达。本研究确认肾脏缺血再灌注损伤的大鼠模型中miR-150水平明显下调，说明miR-150是NF-κB p65的潜在靶基因。而进一步改变NF-κB p65的表达，发现miR-150作为NF-κB p65的直接靶标是有效的，并且NF-κB p65敲除后miR-150表达有所上调。结果表明，在I/R损伤的大鼠模型中，NF-κB p65不仅与miR-150作用形成负反馈回路，还可直接激活miR-150的活性。研究表明，miR-150可以抑制血管内皮生成因子及其受体的表达，敲除miR-150可导致炎症反应增强[9-10]，此研究恰好解释本研究结果，NF-κB p65的激活下调miR-150表达，进而减少炎症反应。

　　典型的瞬时受体电位通道（transient receptor po⁃tential cation channel,TRPC）是TRP超家族的成员，其特征是非选择性Ca2+渗透性阳离子通道。TRPC亚家族在哺乳动物中包含7个成员TRPC1-TRPC7，其中TRPC6已被报道分布在肾细胞的质膜中，包括足细胞、肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞[11]。有研究表明，TRPC6参与了足细胞损伤的过程，除高血压肾损伤外,其余肾组织TRPC6表达评分均高于正常肾组织，提示TRPC6可能成为肾脏疾病的致病因子[12]。在I/R损伤的大鼠模型中，miR-150也调节TRPC6的表达，miR-150模拟物可降低TRPC6水平。通过WB实验和q-PCR实验证明，NF-κB p65能抑制miR-150和激活TRPC6蛋白表达水平，而TRPC6可以抑制炎症小体NLRP3的激活，进而减轻肾I/R损伤[13]。

　　综上所述，NF-κB p65可通过调节miR-150/TRPC6信号通路逆转肾损伤可能与炎症有关。但NF-κB p65/miR-150/TRPC6对肾缺血再灌注损伤的保护作用是否还有其他作用机制的参与，还有待进一步研究。

　　[参考文献]

　　[1]Guo A,Wang W,Shi H,et al.Identification of hub genes and pathways in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury using bioinformatics analysis of the gene expression omnibus(geo)dataset and integration of gene expression profiles[J].Med Sci Moni,2019,25:8403-8411.

　　[2]Dong B,Ding C,Xiang H,et al.USP7 Accelerates FMR1-mediated ferroptosis by facilitating tbk1 ubiqui⁃tination and dnmt1 deubiquitination after renal ischemia-reperfusion injury[J].Inflamm Res,2022,71(12):1519-1533.

　　[3]张彦红,韩永明,陈泽斌,等.TRPC6通过GSK-3β/β-catenin通路调控EMT减轻TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞损伤[J].华中科技大学学报:医学版,2022,51(4):443-448.

　　[4]任欣会,原霞.FGF1通过miR-150对高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞凋亡及纤维化因子表达的影响[J].福建医科大学学报,2022,56(2):104-110.

　　[5]朱妤,王晶晶,吴芳.miR-150-5p在糖尿病肾病模型小鼠肾组织中的表达和对小鼠足细胞MPC5损伤的影响及其机制[J].吉林大学学报:医学版,2022,48(1):44-51.

　　[6]Xin W,Qin Y,Lei P,et al.From cerebral ischemia to⁃wards myocardial,renal,and hepatic ischemia:exosomal mirnas as a general concept of intercellular communica⁃tion in ischemia-reperfusion injury[J].Mol Ther Nucleic Acids,2022;29,900-922.

　　[7]吉芳,伊合山·艾尼瓦尔,张静静,等.NF-κB信号通路在大鼠肾缺血再灌注损伤致心肌损伤中的作用[J].新疆医科大学学报,2019,42(11):1404-1408,1413.

　　[8]何荃,王萌,魏萌,等.冬凌草甲素抑制NF-κB p65活化对糖尿病肾病幼龄大鼠肾损伤和免疫紊乱的影响[J].西部医学,2019,31(11):1646-1650,1656.

　　[9]Liu Z,Dong Z.A cross talk between HIF and NF-κB in AKI[J].Am J Physiol Renal Physiol,2021,321(3):F255-F256.

　　[10]Tian H,Wu M,Zhou P,et al.The long non-coding rna malat1 is increased in renal ischemia-reperfusion in⁃jury and inhibits hypoxia-induced inflammation[J].Ren Fail,2018,40(1):527-533.

　　[11]Dryer SE,Kim EY.The Effects of TRPC6 knockout in animal models of kidney disease[J].Biomolecules,2022,12(11):1710.

　　[12]郭晓红,张涵,胡杰,等.瞬时受体电位阳离子通道蛋白6和整合素连接激酶在以蛋白尿为主要表现的慢性肾脏病中的表达[J].中华肾脏病杂志,2017,33(5):378-384.

　　[13]Shen B,Mei M,Ai S,et al.TRPC6 inhibits renal tubu⁃lar epithelial cell pyroptosis through regulating zinc in⁃flux and alleviates renal ischemia-reperfusion injury[J].Faseb J,2022,36(10):e22527.
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